细胞污染原因及处理.doc

细胞污染概述 凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。一、物理性污染的来源、危害及预防物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温 度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响 。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室 的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培 养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实 验，以避免过冷的温度对细胞的影响。二、化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染 。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生 长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系 其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时 膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒 素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水 。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血 清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验 时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。培养液、培养附加成分、试剂 培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行 纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。培养器皿及容器 细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器 皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存 不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。微生物污染 由于体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而在培养基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。一般在细胞受到污染早期或污染较轻时，能及时处理并除去污染物，部分细胞还有可能得到挽救。但当细胞持续在污染环境中生长时，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞浆中出现较多的颗粒物质；较重的细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。 不同的微生物污染物对细胞的影响也有差别，微生物中支原体和病毒对细胞形态和技能的影响是长期的，缓慢的和潜在的。而霉菌和细菌增殖迅速，能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。霉菌污染表现：真菌的种类很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝，较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。处理：用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗清水擦洗75%酒精擦洗紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。污染发生了除了常规的处理以外，一定要彻底处理污染材料，焚烧，不要留在实验室，不然容易重复污染，空气要甲醛熏蒸消毒。孢子对紫外的抗性很强。人员的个人卫生也重要，试验服洗洗晒晒吧，不留长发，常洗澡。霉菌污染的原因：1、制作时灭菌不完全,可以增加灭菌的时间到40分钟试试看2、灭菌完全但是灭菌后无适当保存,可以将LB保存在4度的环境要使用时再回温并且注意瓶盖是否有完全密闭3、操作不当,操作时未按照无菌操作原则保持无菌环境或者是操作人员双手未先以70%的酒精消毒4、菌种受到污染,所种的菌种已经受到霉菌的污染,建议换掉菌种5、不论是受到何种因素污染皆可以利用简单的对照组实验来找出污染的原因。有霉菌的话紫外杀菌要 长一些 ，三十分钟左右；超净工作台霉菌与细菌最好分开用，如果超净工作台系统染菌的话，恐怕要进行一次彻底杀菌了；培养基ph值可以适当调高一些，霉菌一般喜欢偏酸性。（1）操作：做实验时应养成无菌观念（操作前用70%酒精檫手，实验时如吸管等物品接触到台面应立即更换，并隔3-5分钟用酒精灯烧灼吸管）。（2）超净台：如果超净台使用时间过长（3-5年以上），应及时更换滤板。消毒的紫外灯管也按时更换。在操作前用酒精或新洁尔灭檫拭台面。超净台长时间使用了的话，要把里面的防尘过滤网拆下来，用吸尘器或者其他东西吸净，洗净。紫外开的时间久一些，同时一定要有些间隔 比如 开20分钟，然后关掉10分钟，再开20分钟。（3）孵箱：怀疑孵箱污染时，将孵箱关掉，然后用上述消毒剂消毒，之后用移动紫外消毒车将紫外灯插入孵箱照射30分钟以上。彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二钠或者硫酸铜。（4）实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。注意过滤器的消毒灭菌。（5）一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。如果用双抗，应该现用现配。细菌污染细菌污染较常见的有大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现，多数情况下培养液短时间内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象；有时静置的培养液起初不混，但稍加震荡，就有许多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类；有的培养液改变不明显而有疑似污染，亦可向肉汤培养基内地入少量培养液，37度培养以检测。处理：仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！一般用抗生素的常用量的510倍作冲击疗法，用药2448小时后再换常规培养液，有时在早期污染时此法有效。细胞培养中用抗生素多为预防细菌污染，一半多联合应用。一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除，有的抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应。培养箱细菌污染的处理：1. 把水槽洗干净，用70%酒精擦两遍. 不放心的话，用酒精喷壶喷一遍，点火烧一下. 然后加入消毒的蒸溜水即可. 最好每周如上操作一次. 也有人在水里加抗菌剂的 。2.湿式培养箱应定期做彻底清洁，湿盘的水中可加1的硫酸铜抑制真菌生长 3.先用过氧乙酸擦拭一遍，加入灭菌蒸馏水，再将固体硫酸铜（大概10G）左右加入水中，溶解后放入孵箱。 支原体污染 黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径02um)并独立生活的微生物约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7680)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后培养液可不发生混浊多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可做如下检酗：相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗置于用生理盐水配浓度为50pgml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗12min向细胞面滴加pH55磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同 围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。电镜检查；用扫描电镜方法简便快速也可以利用透射电镜。DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高但方法较为复杂处理：（1）加温：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放在41度作用45小时，最长不超过18小时，以杀灭支原体。但如此高的温度对细胞生长本身也有影响，因而在实验前先用少量细胞膜所最适合的温度和时间，以尽可能保证杀灭支原体而细胞本身又不受损伤。（2）动物体内接种：将受支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借体内的免疫系统杀灭支原体。待一定时间后，取出做原代培养再繁殖。（3）用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。红霉素有效，而且不影响细胞生长。细胞刚开始被支原体污染的时候，细胞生长极为缓慢，而且状态不好，细胞之间及底部总有一些亮晶晶的颗粒状物质，换液后好些，但过2天又会增多，培养液清亮，严重时象一层细沙铺在瓶底。刚开始以为是消化过头引起的细胞的碎片和细胞内的颗粒，后来发现与胰酶消化无关。使用红霉素（就在医院的门诊购买，很便宜）后这种现象明显好转，背景干净，细胞生长很快，状态明显好转，但好像红霉素不能完全根治支原体感染，停药后一段时间可以复发，但如果细胞很重要有没有多余的细胞时可以考虑一试。 真菌污染：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。黑胶虫污染 可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。原虫污染 培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。污染的可能原因：可能原因很多。比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水2、超净台取材器材培养液培养瓶操作等因素3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。细胞交叉污染细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。防治及处理：（1）在进行多个种类细胞培养操作时，所有器具要严格区分，最好作上标记以区分。对每一种细胞按顺序进行操作，避免一起操作时造成的混乱。（2）进行换液或传代操作时，注射器或滴管不要接触培养瓶瓶口，避免把细胞带到培养液瓶中。在进行其他细胞操作时导致细胞污染。（3）所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。干细胞培养中出现污染一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。二、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。四、病毒污染采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。五、非同种细胞污染由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如灵长类细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在句却认为是HeLa细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。 间充质干细胞培养的污染防控 在体外进行间充质干细胞培养非常容易受到外部环境的污染，通常污染一旦发生纵然相近一切办法也都无法挽回。因而在细胞培养时重要的是预防污染的发生，这一点很关键。特别是操作时每个步骤都需要严格掌控不能够出现丁点儿马虎，整个培养过程预防污染都要进行到位，这样才可以降低污染发生的几率以及程度。预防污染我们经常从以下几个方面入手：1.添加抗生素 各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好（但迄今尚无对抗支原体特效抗生素）。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。2.从物品、用品消毒灭菌着手 细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体