斑马鱼的软骨发育及其矿化过程.doc

精品文档摘要斑马鱼，作为发育生物学研究的最佳脊椎动物模型，为人类的相关研究提供了重要的参考依据。本文主要讨论了斑马鱼幼体的软骨，特别是脊椎软骨的发育过程及其软骨的超微结构特点。为转基因、基因突变鱼类的研究提供了对比依据。本文主要讨论了斑马鱼脊椎软骨的发育进程，以及软骨细胞特别是脊索旁软骨的排列，形貌，大小及其显微结构特点和中胚层分化的显微形貌。斑马鱼脊椎软骨在配卵后23天开始发育，围绕在脊索周围，并逐渐向神经管和血管方向延伸。斑马鱼脊椎软骨沿体节发育，腹部以前的体节在6天已基本分化为软骨细胞，并且随着时间的推移，沿体节向尾部方向的生骨节逐步分化为软骨细胞，在1个半月左右的时间，软骨组织的分化基本完成。斑马鱼的软骨组织排列整齐，大多数细胞大小在520m范围内。斑马鱼的软骨组织为透明软骨，胶原纤维为II型胶原，没有典型的周期结构，含量很少。在TEM的观察中发现，斑马鱼的肌肉组织分化较早，在3天已基本分化完成。而体干部的脊索旁仍为中胚层的间叶细胞，为软骨细胞的原基，在分化成软骨细胞的过程中，首先是在形状和排列上趋于整齐和规则。斑马鱼的骨化方式为软骨骨化。软骨细胞的细胞质中富含大量的线粒体和内质网。在细胞质中还有大量直径为100-400nm的囊泡，紧密排列在一起，起传输物质的作用。此外，脊髓处的细胞，其细胞核较大，细胞质很少，有别于软骨细胞。并且该处细胞有部分已死亡，被其它细胞所代替。关键词：软骨细胞，发育，显微结构AbstractZebrafish provides an important referenced foundation for the relative research as the best pattern of vertebrate in developing biology. In this paper the process of development and the ultrastructure of the cartilage especially the parachordal cartilage in zebrafish larva are investigated . And that supply the contradistinctive basis for the research about transgenic and gene mutation fishes.Here we investigate the developing process of parachordal cartilage and chondrocyte arrangements,shapes ,size,and ultrastrcture .In zebrafish parachordal cartilage begin to form at 2-3 days postfertilization ,and surround the notochord and extend gradually to spinal cord and dorsal aorta. Parachordal cartilage develop along somite and at 6 days postfertilization the somite before venter have differentiated and all accomplish differentation on the whole about at one and a half month postfertilization .The chontrocytes arrange regular .The size of chontrocytes is between 5-20m mostly. In zebrafish the cartilage is hyaline cartilage and the collagen fibrils is predominantly II type fibrils. And that are relatively thin and do not display the characteristic 67nm banding.We discovered that the differentiation of musculature is more earlier than cartilage by TEM and that accomplished basically at 3 days postfertilization. During the differentiation of cartilage the shape and arrangement of mesenchymal cell in mesoblast go to orderliness and regular gradually at first. With the electron microscope ,the active cartilage cell is seen to contain numerous slick endoplasmic reticulum,mitochondria and vesicles which arrange together in order and the diameter of these vesicles is about 100-400nm, transmitting the substance. Furthermore, the nucleolus of spinal cord cells is more larger and we also can observe that some cells have dead. Keywords : cartilage ,development, ultrastrcture第一章. 前言由于软骨细胞所致的成骨活动发生较早，所以对斑马鱼软骨发育的研究在骨损伤修复过程中对骨力学功能恢复有较大意义。同时，认识软骨组织的发育过程及其形貌特点，对于认识生物矿化的过程和机制有很大的辅助意义。生物矿化本质上是一个受基因精确表达与调控的过程，因此研究矿化基质蛋白的基因位点和基因表达调制的细节，研究基因调控下的生物矿化过程将是搞清矿化控制机理的根本解决途径。从分子水平上研究软骨、骨的发育及矿化机制不仅使我们的认识更深入，同时对于骨的损伤修复及仿生材料的制备有很大的指导意义。关于斑马鱼脊椎软骨的发育过程的研究报道很少。斑马鱼脊椎软骨发育的开始时期约为配卵后2- 3天左右，主要集中在体节的前端。目前，关于脊椎软骨的形貌观察主要在组织水平上，未有从分子水平上的进一步研究。所以搞清斑马鱼脊椎软骨的发育进程和显微结构是研究转基因和基因突变斑马鱼软骨结构变化的基础和前提，为从分子水平上的进一步研究提供了重要的对比依据。第二章文献综述1.硬骨鱼的胚胎发育1.1 卵裂、囊胚及原肠胚的形成1.1.1 卵裂卵受精后发生卵质分离，使细胞质与卵黄明显分开，细胞质集中于动物极形成一帽状的胚盘，后者与围于卵黄四周一层很薄的称为卵黄细胞质层（yolk cytoplasm layer）的细胞质相连。图2-1卵裂为盘状卵裂。第一次卵裂的分裂沟自动物极向下但不达到胚盘的底面，因此在胚盘底部还有一薄层细胞质（细胞质间桥）使分裂球彼此相连。第二次卵裂则与第一次卵裂相互垂直，形成大小相似的4个细胞。第三次卵裂有两个卵裂面，都与第一次平行，结果形成4排，每排为4个分裂球的16个细胞。这三次卵裂的分裂沟与第一次一样都达不到胚盘底面，因此分裂球之间在底部仍通过细胞质间桥彼此相连。从第五次分裂起，卵裂面渐渐不整齐，细胞大小也不一样。有的鱼类从第五次卵裂时，中央几个分裂球成切线裂，即分裂面与胚盘表面平行，将分裂球分为上下两层，上层分裂球为完整的细胞，下层分裂球的底部仍旧没有质膜包围，通过细胞质间桥与相邻的分裂球以及与卵黄细胞质层相连。在斑马鱼，第五次卵裂后只有胚盘边缘的细胞通过细胞质间桥与卵黄细胞质层相连，直到第十次卵裂都是这种情况。位于胚盘下面的腔称为胚盘下腔（subgerminal cavity）。1.1.2 囊胚随着卵裂的不断进行，胚盘分裂球数量日益增多，称为被膜层，它是一连续的细胞层，细胞排列较为紧密，其边缘附着于表胚层上；另一部分位于被膜层下，为一群疏松的细胞团，称为深层细胞。在深层细胞与卵黄之间的空腔称为囊胚腔。在胚盘下面卵黄表面为一层非细胞层（也即最早位于卵黄四周的卵黄细胞质层）称为表胚层或卵黄融合层（yolk syncytical layer），因为它有许多核但无质膜相间隔，所以又称为卵黄多核体。表胚层可分为内表胚层和外表胚层：前者指位于胚盘下的部分；后者指位于与胚盘四周相连部分。外表胚层向外与包在卵黄外的卵黄细胞质层相连。表胚层的形成过程，在斑马鱼已经研究清楚，它是在第九次卵裂后开始形成，在第十次卵裂结束时完成。第九次卵裂后与卵黄细胞质层相连的胚盘的边缘细胞界限逐渐消失，边缘细胞似乎倒坍到卵黄细胞层中，致使此层明显加厚。边缘细胞的细胞核通过有丝分裂不断增加核的数量，而形成卵黄多核体，就这样形成了表胚层。表胚层的主要作用有三：将消化卵黄的物质传递到分裂腔（囊胚腔），然后被分裂球利用；作为胚盘和卵黄之间的过渡地区；作为原肠作用时胚环的细胞外包扩展的附着基质。1.1.3 原肠胚的形成硬骨鱼原肠作用最明显的特点是外包和集中。斑马鱼囊胚时胚盘也是由被膜层细胞和深层细胞组成。原肠作用开始时，与外包的同时，胚盘边缘的深层细胞发生内卷，由于这种内卷作用使胚盘分为上胚层（将来成为胚胎的外胚层）和下胚层（将来成为胚胎的中胚层和内胚层）。在深层细胞发生内卷的同时，上、下胚层细胞向原肠胚的背部集中和伸展而形成胚盾。胚环形成后可分为上、下两层：上胚层和下胚层。上胚层包在卵黄之外，形成卵黄囊的外胚层和中胚层；下胚层细胞则不断向胚盾集中，形成正在不断增长的胚胎的中胚层，这点与两栖类和鸟类胚孔形成时的形态发生运动是不同的。胚盘外包首先是由于外表胚层的皮层中的微丝网发生收缩，使其表面卷曲变狭，这就对同它密切相连的被膜层产生一种拉力，同时也对内表胚层产生一种拉力，使被膜层和内表胚层一起下包。而内胚层表面有许多长的微绒毛，它们随外包的进展而逐渐变短，这就为外包时提供足够数量的膜；同时在这些微绒毛中也有大量的微丝，为外包也提供了收缩条件。此外，接近表胚层的被膜层细胞的皮层中也有许多微丝网，同时还以紧密连接和闭锁连接相连接，这也为外表胚层产生拉力是把被膜层一起向下包提供了结构上的条件。如果把外表胚层连接的被膜层边缘切去，胚盘立即缩回去，胚盘就不发生外包，而表胚层仍能独立完成其外包过程，并且外包的速度要比有胚盘存在的更快。被膜层在外包时其细胞数量增加不多，所以外包不是依靠它的细胞数量的增加，而是依靠细胞形状发生改变和细胞的重新排列，细胞纵向伸长的结果。被膜层不参与胚胎的器官发生，只形成胚胎的外胚层表皮。由于胚盘不断向植物极外包，最终在植物极处形成一胚孔，至此原肠作用才告结束。1.2 早期胚胎的形成1.2.1神经系统的形成在被膜层下面的预定神经物质向中央集中形成一实心的，以后在此细胞索中央裂出缝状的腔，逐渐成为管状的神经管。在神经管前端膨大成脑部，并产生两个收缩，这样就把脑部分为前脑泡、中脑泡和后脑泡，其后为管状的脊髓。硬骨鱼的前脑很不发达，因此不形成脑曲。首先在前脑两侧凸出一对视囊，这时前脑分为端脑和间脑。端脑向前伸出一对较长的嗅神经和嗅球。在端脑和间脑交界处的脑部顶壁甚薄，附以血管形成前脉络丛。间脑除两侧为一对视囊外，其顶壁有一不发达的脑上腺突起，腹壁也形成一漏斗，与来自外胚层的脑下腺组成垂体。从漏斗向后伸出一囊状突起，它的壁很薄，与头部的静脉血窦相遇，由于囊状突起不断生长，囊壁产生许多皱褶伸入静脉血窦，组成一个复杂的血网状体，称为血脉囊。这器官在深水鱼中十分明显；在淡水鱼中极不发达，仅为一痕迹器官。因此，血脉囊可能是生活于深水鱼类的特征，与检测水的深度和压力有关。中脑的背壁发育为视叶。后脑分化为小脑和延脑。1.2.2脊索和内胚层的分化在神经物质下面为脊索、中胚层和内胚层，后者刚好位于表胚层之上，为一层扁平细胞。脊索中脑层位于神经物质和内胚层之间。脊索向前达到耳囊处，向后则终止于尾端。在眼发生之后，脊索细胞内发生空泡化，其外的细胞形成脊索鞘。原肠作用结束后不久，内胚层细胞向中央集中形成一条细胞团，尔后内部逐渐出现空腔，在前端空腔扩大成咽，后端的腔出现较晚。这就是原始的消化道。口腔是由前脑腹面的外胚层加厚成细胞团，然后产生空隙扩大而成的，并与咽相通。咽部有6对咽囊（第1对为舌颌囊，后为第26对咽囊），与其外胚层凹陷的鳃沟相通成为鳃裂。舌颌囊不与鳃沟相通，因此鱼类只有 5对鳃裂。鳃盖亦由舌弓形成。甲状腺由咽部腹壁产生一对实心细胞团所形成，胸腺则从咽囊背壁分出的细胞发育而成。肝在消化道尚未形成之前，由食道后端内胚层细胞索的腹面突出一团细胞所组成。与消化道产生的同时，这团细胞增殖形成分支的肝索，并产生空隙与消化道相通，这就是胆管。胰是在肝突形成的同时，在内胚层细胞索的背部突出一细胞团，将来发育成胰。随发育与肝紧靠，由胰管通人消化道背侧。当胚孔闭合时，在胚体后端有一致密细胞团，此即末球，它由脊索、中胚层和内胚层所组成，与两栖类的尾芽组织相类似。胚体的加长就是由末球不断增生，以增加这些胚层的细胞。在末球的前方有一囊状结构，这就是硬骨鱼所特有的Kupffer氏囊，它随末球向后分化也向后方迁移，待胚体长足时此囊仍留在尾部的出发点，以后闭塞，自行消失。所以，Kupffer氏囊只是由内胚层细胞间的空隙组成，其意义不明。1.2.3 中胚层的分化在胚胎发育到原肠后期，中胚层由下胚层分离出来以后，排列于脊索两侧、内外胚层之间。位于脊索两侧的中胚层可分为背侧和腹侧两部分，背侧部形成体节，腹侧部则形成侧板。随着胚胎的发育，头部的中胚层分散形成间叶细胞，将来分化为六条眼部肌肉（眼肌）以及下颌收肌、鄂弓提肌、鄂弓收肌、鳃盖提肌和鳃盖收肌等头部肌肉。而体干部的中胚层分化为粗厚的体节（节板中胚层）和斜列于胚体两侧的侧板中胚层以及节板中胚层与侧板中胚层之间的血管带，它们进一步分化如下：（一）体节 硬骨鱼类的体节是致密无腔的结构，与其他脊椎动物一样，不久，它分化为下列三部分：1生肌节 由体节内侧大部分中胚层细胞分化而成，生肌节的腹侧部细胞将将沿着侧板与外胚层之间的区域向腹面伸展分化为横纹肌，在鱼类的尾部没有内脏器官和侧板，这里的生肌节平行地向腹面伸展，并在腹面相互连接，同时分化为尾部的横纹肌。生肌节在发育过程中，为了适应身体的运动，其形状不断改变。在发育的早期，即生肌节刚形成时，呈简单的方形，以后由方形变为“人”字形，这时胚胎在膜内可作抽搐状收缩运动，以后进一步变成“W”形，并在肌节之间出现结缔组织隔膜（肌隔），这样可使幼鱼和成鱼具有很强的游泳能力。不同鱼类的胚胎和仔鱼，各具有自己特有的肌节数。各种鱼类的躯干肌（自头部至肛门）和尾部肌节（自肛门至尾端）的数目也不同。躯干年尾部肌节数目之间的比例是分类学上的一个特征，根据该特征可将一些鱼类的胚胎或仔鱼和另一些鱼类的胚胎和仔鱼区分开来。鱼类胚胎和仔鱼的不同肌节数目，系决定于它们的生态学特点，例如在鲤科鱼类中，肌节数目最多（4448对）的是栖息于急流中营岩石上产卵的鱼类，这样可保证它们具有较大的活动性。而生活在比较平静的水域中并过着不太活动生活方式的草上产卵鱼类的仔鱼，其肌节数较少（3840对），肌节数最少的喜贝类产卵鱼类的仔鱼，它们长期处在双壳贝类（如河蚌）的外套腔内发育，南开贝体后即生活于不太流动的静水水域内。2生骨节 由位于生肌节腹面内侧的体节细胞分化而成，为鱼类骨骼系统的原基。生骨节细胞从肌节中分离出来以后形成中胚层的间叶组织，它们随着胚胎和仔鱼的发育而迁移到一定的生骨区分化为不同的骨骼。鱼类的生骨区有：皮肤区，分化产生鳞片及其衍生物；水平隔区，位于体侧上下轴骨之间，在此分化产生背肋；背生骨隔区和腹生骨隔区，分化产生奇鳍的支鳍骨；肌隔区，位于前后两肌节之间，分化产生肌间骨；围绕脊索、神经管及中轴血管区，分化形成脑颅和脊柱；咽颅区，分化形成咽颅骨骼；附肢区，分化形成偶鳍和奇鳍的骨胳。绝大多数鱼类的骨骼是硬骨，它们的发生方式分为两种：一是由分散的生骨节中胚层间叶细胞先分化为软骨，然后再骨化成硬骨，这类骨骼称为软骨化骨；另一方式是由分散的生骨节中胚层间叶细胞直接骨化成硬骨，这种骨称为膜骨。3.生皮节 位于生肌节外测的体节细胞群分离而成，将来分化为真皮和皮下结缔组织，并参加鳞片的形成。（二）侧板（侧板中胚层） 自体节分离出以后，便沿着胚胎或仔鱼地两侧向腹面伸展，同时分为两层，靠近内脏的一层称为脏壁中胚层，它们之间所形成的腔隙，在体干前端心区的腔称为围心腔，围心腔后部（体干部）的腔称为体腔。（三）血管带 它是硬骨鱼类胚胎特有的结构，位于体节与侧板中胚层之间。在体干前部的血管带呈薄板状且不分节，称为血板；胚体后部（自第5体节至尾部）的血管带较粗厚，其横断面呈三角形，称为中间团。血管带是硬骨鱼类循环系统的原基。脊椎动物三胚层的分化表胚胎成体外胚层体壁外胚层表皮皮肤的表皮和其衍生物（角质构造和皮肤腺）口腔和直肠末端的上皮感受器脑垂体前叶神经嵴鳃部骨骼神经节和感觉神经肾上腺髓质神经管脑和脊髓脑神经合脊神经的运动神经视网膜和视神经脑垂体后叶内胚层原肠及其突出物消化道内层肝脏和胰腺呼吸系统内层膀胱和尿道内层一部分内分泌腺中胚层脊索脊索，其后被脊椎骨所替代上节生皮节真皮生骨节脊柱生肌节骨骼肌中节排泄系统生殖系统的一部分下节体壁层腹膜脏壁层脏膜系膜心血管系统，血细胞生殖腺平滑肌体腔体腔2.软骨组织的特点及其分类2.1 软骨组织的结构软骨是一种结缔组织，包括软骨细胞和细胞外基质。软骨细胞位于被称作陷窝的腔内，陷窝外是胞外基质，包括软骨基质和胶原纤维。同腱和韧带之类的结缔组织一样，软骨是无血管的组织，基质提供了周围结缔组织和软骨细胞之间物质扩散的通道。软骨的基质是固态的，坚硬而有一点弹性，这正解释了软骨特殊的回弹特性。符合软骨在承重和在关节特殊的运动中所起的作用。所以软骨成为骨生长过程中的一个重要的组织。2.2 软骨膜软骨周围覆有一层较致密的结缔组织，称为软骨膜。分为两层，外层较致密富含纤维，主要起保护作用；内层疏松，富含细胞、血管及神经，能形成骨原细胞，分裂分化形成软骨细胞。所以软骨膜能保护和营养软骨，同时对软骨的生长有重要的作用。2.3 软骨类型通常来讲，根据基质的特性不同，软骨分为三种类型：（1）透明软骨，（2）纤维软骨，（3）弹性软骨。透明软骨基质中的胶原纤维含量较少，主要是II型胶原，没有典型的周期结构。弹性软骨基质除了胶原纤维和基质外，其软骨基质还包含大量的弹性纤维和层状的弹性物质，相互交织成网状。弹性物质提高了软骨的弹性，外耳软骨的良好柔韧性即是很好的证明。同透明软骨不同的是，弹性软骨基质不矿化。纤维软骨的基质包含有大量的很明显的粗胶原纤维簇，主要是I型胶原，平行或交错，软骨细胞较小而少，常成行排列。透明软骨：透明软骨具有玻璃状的，均一的不定型基质。在软骨中分布着许多被称作陷窝的腔，陷窝内是软骨细胞。陷窝周围是胞外基质，它由两种组元构成：胶原纤维（主要是II型胶原）和基质。透明软骨的基质的化学分析表明了三种糖胺聚糖的存在：透明质酸，硫酸软骨素和硫酸角质素。硫酸软骨素和硫酸角质素结合在轴心蛋白上形成了蛋白多糖单体。在组织中，透明质酸和大约80个蛋白多糖单元联合形成大的聚合体，其结构由连接蛋白所加固。软骨基质也包含其它的不形成聚合体的蛋白多糖和无胶原、无蛋白多糖的糖蛋白。同其它的基质一样，软骨基质也是高度水合的。透明软骨净重的60%-78%是水。这些水的大部分是结合水，这正解释了软骨的回弹性。然而，一些水结合较弱，足以允许小溶质的扩散。在关节软骨中，水的含量有局部的改变。这些改变发生在关节的运动过程中和关节受压时。高度的含水量和水的运动影响软骨基质对压载荷的改变作出的反应及软骨的承重能力。尽管透明软骨的基质是均一的，无定型的，但基质的成分并不是均匀分布。因为大量的硫酸盐类的存在，蛋白多糖经基本染剂和苏木青染色，这样，在软骨染色的断面上嗜碱性细胞增多的现象提供了硫酸盐类蛋白多糖的分布信息。这些物质迅速集中在陷窝的周围。这一环状的深度染色基质被传统的组织学家命名为被膜。在细胞团簇附近也有一些浓度稍低的硫酸盐类蛋白多糖，这些区域被称为区基质。在离细胞较远的基质区域硫酸盐蛋白多糖的含量很低，这些区域被称为区间基质。除了存在蛋白多糖分布的区域差别，同时还存在与年龄有关的差别，即随着软骨年龄的增长，蛋白多糖含量减少。2.4 软骨生长软骨存在两种生长方式。1. 内积生长（interstitial growth）：软骨细胞在软骨基质内可继续发育、分裂和不断产生新的基质和纤维，使软骨从内部生长。2. 外加生长（appositional growth）：由软骨膜内层的骨原细胞向软骨表面不断添加新的软骨细胞和细胞间质，使软骨从表面向周围扩大。2.5 软骨骨化生物内大多数的软骨在生长过程中逐渐替换成骨。软骨骨化包括软骨周骨化和软骨内骨化。1. 软骨周骨化 软骨膜内层的骨原细胞分裂分化为成骨细胞，在软骨表面形成类骨质，称为骨领。骨领不断钙化为骨质并向骨的两端扩展，逐渐形成骨干。2. 软骨内骨化 骨领包围的软骨部分，软骨细胞肥大，软骨基质迅速钙化，随后软骨细胞因缺乏营养而迅速退化死亡。骨膜的血管连同破骨细胞和骨原细胞等穿越骨领，进入软骨。破骨细胞将钙化的软骨基质逐渐分解吸收，形成了许多与骨干长轴平行并相互连通的隧道，即原始的骨髓腔。然后，骨原细胞分裂分化为成骨细胞，在残留的钙化软骨基质表面形成类骨质，并渐钙化为骨质，形成许多骨小梁，软骨内出现了初级骨化中心。初级软骨中心由骨干中央向两端不断扩展。同时骨领也不断增长、增厚，使长骨增长和骨化。软骨内骨化是骨发生、生长和损伤修复的一种成骨方式。在成骨过程中软骨组织中的肥大软骨细胞分泌基质、钙化、死亡，软骨组织退变、崩解、被吸收，血管侵入，成骨细胞产生骨组织。目前对体外（in vitro）、在体（in vivo）软骨、骨组织和细胞活动的研究手段主要有核酸杂交技术、免疫组织化学、组织计量学和放射自显影技术等。对细胞活动的定性、定位及其定量主要依靠其特征性产物来确定。软骨细胞可产生特征性的、和型胶原，肥大软骨细胞还可产生特征性的型胶原。各期的软骨细胞均有酸性磷酸酶的活动。骨钙素是成骨细胞的特征性产物，它是骨中最丰富的非胶原蛋白，它的表达说明细胞具有成骨的特性。骨桥素对细胞增殖和矿化很重要，膜内化骨和软骨内化骨组织中，前成骨细胞、成骨细胞和骨细胞中均含有这种蛋白。骨涎蛋白在矿化组织的细胞内存在，认为它是羟基磷灰石的晶核。骨连接素是一种酸性磷蛋白，最先在骨基质中发现，含量丰富，以后在包括软骨细胞的各种其它细胞中均有表达和分泌。3. 斑马鱼120h内的发育特点3.1 斑马鱼发育生物学研究的最佳脊椎动物模型在脊椎动物发育生物学研究方面，由于缺少适当的研究模型，有关早期发育阶段，基因表达调控的研究始终未获突破性进展。包括小鼠、鸡、爪蟾等在内的一些脊椎动物都只适用于胚胎学或者遗传学某一学科的研究，均不是理想的发育生物学研究模型。小鼠的胚胎太小，幼体和成体又太大，这使得进行大规模的突变体实验有很大的困难。此外，小鼠的胚胎又在体内，很难移动。鸡和爪蟾都是很好的胚胎学研究模型，但它们繁殖慢，记录后代的遗传信息很困难，并且母体太大，价格昂贵，不适合大规模突变体研究。而一种小型的鲤科鱼斑马鱼，由于其诸多的优点，逐渐成为发育生物学研究的最佳脊椎动物模型。斑马鱼个体小，成体只有3-4cm，并且价格便宜，易于在实验室内大规模的养殖。同时，斑马鱼产卵量大（几十到上百），产卵周期短（几天到两周），卵大，胚胎在体外发育，胚胎发育速度快，通常2-3天即发育成幼体。而在转基因的研究中注入的mRNA通常在48小时后降解，对于斑马鱼来说，因其胚胎发育速度快，所以基因有足够的时间进行表达。斑马鱼早期的胚胎完全透明，单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易。这些特点使它成为很好的脊椎动物胚胎学、遗传学研究模型。此外，尽管斑马鱼不是哺乳动物，但它作为脊椎动物与人体有一定的相似之处，对斑马鱼某些基因及其软骨、骨的矿化机制的研究对人体的发育及同源基因的表达等方面均有重要的意义。同时，从基因水平上研究软骨、骨的发育和矿化对人类仿生材料的研制提供了重要的依据。3.2 斑马鱼幼体纵截面组织切片图1. 24h的斑马鱼图1-1图1-22. 48h的斑马鱼图1-3 图1- 43. 120h的斑马鱼图1-5图1-64. 生物矿化生物矿化是指在生物体内形成矿化材料的过程。由细胞分泌的有机物自组装成的有机物对无机物的形成和聚集起模板和控制作用。基质和矿物间动态的相互协调作用，才使得无机矿物具有一定的形状、尺寸、取向和结构。生物矿化过程是一个天然存在的高度控制过程，该过程受基因、细胞和细胞外基质的调制，在分子水平到介观水平上对晶体形状、大小、结构、位向和排列实现精确控制和组装。该过程涉及胶原蛋白等有机体系，磷酸钙、碳酸钙等无机体系和多类型细胞体系三方面的相互作用。理解这一复杂系统中生物结构的高度选择性控制、以及基质和矿物的复合机制是研究生物矿化的关键问题。5. Hedgehog基因家族Hedgehog基因家族编码一类分泌性信号分子，是1980年由sslein-Volhard和Weieschaus通过突变筛选在果蝇中首先发现的，于1992年被克隆。hh基因在果蝇的体节和成虫盘等的图式形成中具有重要作用。Hh控制TGF （transforming growth factor ）,Wnt和FGF(fibroblast growth factor )信号分子的表达。随后，在不同无脊椎动物（如海胆、水蛭和甲虫）和脊椎动物（如斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠和人）中均发现了同源基因，构成一个基因家族。目前在果蝇和其它无脊椎动物中仅发现了一个基因，而在脊椎动物中则具有多个同源基因，包括Sonic hh (Shh)、Indian hh (Ihh)、Deserth hh (Dhh)等。其中Shh在脊椎动物神经管、体节和肢等的发育中起着关键作用，Dhh和Ihh则分别参与精巢和软骨等的发育。在小鼠、鸡和斑马鱼中，Shh基因的表达均开始于原肠胚期，分别出现于头突、亨氏节和胚盾处，然后逐渐扩展到整个预定脊索中胚层，随后在神经管腹侧基板中也开始表达。在小鼠和鸡中，Shh基因在脊索中的表达至少持续到体节发生结束，但在斑马鱼中Shh基因在脊索中的表达随着它在神经管基板中表达的开始而逐渐减弱，到22体节时Shh基因在中胚层中的表达已仅限于尾部脊索和尾芽中的少部分未分化细胞。这种差别的意义仍不清楚。有人认为诱导基板产生是脊椎动物Shh基因最原始的功能，而其它信号功能如诱导运动神经元的分化是随后产生的。第三章 实验方法1. 斑马鱼的获得斑马鱼【Zebrafish (Danio rerio)】取自清华大学生命科学学院分子发育实验室，在28.5，按标准方法养殖。2. 透射电镜样品的组织固定及包埋将斑马鱼幼体直接至于容器内，进行如下处理：1. 用0.1M的磷酸缓冲液（PH=7.2）进行清洗。2. 2.5的戊二醛磷酸缓冲液固定23小时。3. 用0.1M的磷酸缓冲液清洗4次，每次15分钟。4. 1的锇酸缓冲液固定2小时。5. 用0.1M的磷酸缓冲液清洗4次，每次15分钟。6. 丙酮脱水： 50丙酮1020分钟70丙酮1020分钟， 4过夜80丙酮1020分钟90丙酮两次，每次20分钟95丙酮两次，每次15分钟100丙酮两次，每次30分钟7. 浸透：2体积丙酮1体积树脂1小时1体积丙酮1体积树脂1小时纯树脂1小时纯树脂4过夜8. spurr氏环氧树脂聚合：70加热10小时。3. 半薄切片的组织染色半薄切片厚度为1，用亚甲基蓝品红染色17，用于光学显微镜的观察。3.1 染色剂的配制3.1.1亚甲基蓝溶液亚甲基蓝 0.130gGiemsa0.020g丙三醇 C.P.10ml甲醇C.P.10ml磷酸盐缓冲液*（PH6.9）30ml蒸馏水50ml*磷酸盐缓冲液：无水KH2PO49.078g无水NaHPO411.876g 加蒸馏水至1L3.1.2品红溶液碱性品红0.100g50%乙醇 至10ml蒸馏水 至 200ml 3.2 染色过程：1 把玻璃片浸泡在65的亚甲基蓝溶液中15分钟。2 去离子水清洗2次。3 浸泡在室温的品红溶液中5分钟。4 去离子水清洗3次5 空气中自然晾干。细胞核兰色；细胞质浅兰色；粘蛋白粉红至紫色；糖和胶淀粉粉红至红色；脂粒灰至浅兰色（有时，黄棕色）；红细胞蓝绿。4. 超薄切片的染色超薄切片用于透射电镜的观察。超薄切片的厚度约为500700。由于未经染色的超薄切片的反差很弱，在电镜下观察时，几乎看不清样品的结构。因此，需要对样品进行染色。其目的是增强样品中各种结构图象之间的反差或选择性地显示某些结构或成分。超薄切片的染色是一种“电子染色”，它只呈现黑白对比度，而不像光学显微镜的厚切片染色那样显现出各种颜色。实验中，染色采用醋酸双氧铀柠檬酸铅双染法。前者主要使细胞核及结缔组织染色，而后者主要提高细胞质成分的反差。第四章 实验设计及其结果与讨论1. 实验设计观察2天、3天、6天、10天的斑马鱼的组织切片和超薄切片，主要利用光学显微镜和透射电镜（JEOL 100-CX）观察斑马鱼脊椎软骨的发育进程，以及软骨细胞特别是脊索旁软骨的排列，形貌，大小及其显微结构特点和中胚层分化的显微形貌。2. 实验结果与讨论2.1 斑马鱼幼体随时间发育的横截面切片图2.1.1 2天、3天、6天斑马鱼腹部及腹前切片图下列图中脊索区域为将来的成骨区，生骨节细胞逐渐分化为软骨细胞，包围在脊索周围，逐渐向四周扩展和骨化。随着发育的进行，脊索消失，该区域被脊椎所代替。2.1.2 10天的斑马鱼头骨连续切片图图4-10 10天斑马鱼头骨连续切片图由图410可见，斑马鱼的头骨发育较早，软骨细胞的形貌与图4-6和图4-7所示的脊索旁软骨细胞基本相同。2.2 斑马鱼幼体的显微结构2.2.1 2天的显微结构图4-11为图4-1中箭头所示位置的显微结构。该区域为脊索区，图中d区域为已分化的肌肉组织，a区域无明显的细胞结构，b区域含有大量的小囊泡，直径在100400nm左右。c区为间叶细胞。图4-11 脊索区的显微结构（6.1K倍） 图4-12 图4-11中(a)区放大图4-13 图4-11中（b）区放大 图4-14 图4-11中（c）区放大图4-15 图4-3中箭头I所示区域 图4-15为外胚层和生肌节分化的肌肉组织。首先在细胞内分化，随着分化的进行细胞结构消失。图4-16 图4-15中（a）区放大 图4-17 图4-3中箭头II所示区域图4-17为生骨节的间叶细胞，尺寸在10m的数量级，形状不规则，无明显得细胞核，还未分化为软骨细胞。2.2.2 3天的显微结构图4-18和图4-19为3天斑马鱼的生骨节细胞（截面C）。 图4-18 3天的斑马鱼生骨节细胞 图4-19 3天的斑马鱼生骨节细胞2.2.3 6天的显微结构右图为6天斑马鱼截面A处的软骨细胞。 图4-20 6天斑马鱼截面A处的软骨细胞图4-21为图4-9中箭头所示的脊索区域的显微照片。图4-22为图4-21中（a）处的肌肉组织放大照片，图4-23为图4-21中（b）处脊索表面的生骨节的放大照片。 图4-21 图4-9中箭头所示的脊索区域图4-22 图4-21中（a）区放大2.2.4 10天的显微结构图4-24为图4-10（i）中箭头所示区域的显微照片，为脊髓区的细胞结构图4-25为脊髓区细胞质中的内质网结构。图4-26和图4-27为脊索旁软骨，图4-28为脊索区。图429为细胞质的线粒体。 图4-23 图4-21中（b）区放大图4-24 10天的斑马鱼脊髓区的细胞 图4-25 10天的斑马鱼脊髓区环状内质网 图4-26 10天的斑马鱼脊索旁软骨 图4-27 10天的斑马鱼软骨 图4-28 10天斑马鱼的脊索区 图4-29 10天斑马鱼的软骨细胞质2.3 结果讨论斑马鱼的脊椎软骨细胞由生骨节细胞分化而成，在配卵后2-3天开始出现21，并围绕在脊索周围（脊索旁软骨），逐渐向脊髓和背动脉方向延伸。并且随着时间的推移，脊椎软骨细胞将沿体节方向逐渐分化。在1个半月左右的时间基本分化完成（见图4-30，该图为张漾博士生的实验结果）。图431为斑马鱼脊椎软骨发育时间模型图。从2天到6天的组织切片图和显微结构图可以看到，2天时的脊索还不明显，存在大量的基质，3天时体节增多，脊索区逐渐变空，范围扩大，开始出现软骨，6天时软骨数目增多，并向脊髓和血管方向延伸。发育模型如图432。过程中同时伴有骨化过程。图4-30图4-31由图4-7可知，斑马鱼的脊椎软骨细胞在发育早期时排列比较整齐，脊索旁软骨末端为单排排列，该处细胞同脊索附近的软骨细胞相比形状更规则，形体较大。并且，从图中可见，斑马鱼的脊椎软骨细胞的大小多数在520m范围内。软骨细胞为透明软骨，排列紧密，细胞外基质含量较少，染色为粉红色，同人类的透明软骨相同22，为葡糖胺聚糖（粘多糖），通常含有三种粘多糖：透明质酸，硫酸软骨素和硫酸角质素。由有关文献和图4-10可知，斑马鱼的头部软骨发育较早，软骨细胞也为透明软骨，多数为单排排列3。图4-32从电子显微水平观察可知，肌肉组织分化较早，从图4-15可见，2天时生肌节已大部分分化为肌肉组织，部分细胞结构消失。由图4-22，6天时截面C处已全部分化为典型的肌肉组织，看不到细胞结构。从图4-11可以看出在2天时脊索区域含有大量的囊泡（V），直径在100-400nm范围，与成鱼的囊泡大小基本相同。该区域仍存在细胞轮廓，但细胞的细节消失，在细胞内为大量的囊泡，局部区域细胞质消失，形成小空腔。从图4-21可以看到，6天时的脊索区域形成较大的空腔，细胞结构消失，在脊索内表面可以看到少量的囊泡。由于基质囊泡在骨形成过程中对蛋白的输运和矿物的形成起着重要的作用。所以可以推测在2天时脊索区域出现的大量的囊泡起着输运和降解细胞质的作用。在图4-24的脊髓区域和图4-18的生骨节细胞以及图4-26的软骨结构中仍可以看到大量的囊泡，而且在脊髓区可看到许多正在死亡的细胞。由此我们可以猜测，囊泡在新旧组织更替和代谢旺盛的区域会大量出现，对基质的输运和新组织的形成有着重要的作用。对于囊泡的具体作用仍需进一步的研究和实验验证。由图4-17和图4-18的生骨节细胞的变化中我们可以看到，中胚层间叶细胞即生骨节细胞的细胞核很大，细胞质含量很少。2天的间叶细胞形状不规则，排列杂乱，而3天的间叶细胞在形状上趋于规则，排列整齐。可见在间叶细胞分化成软骨细胞的过程中，首先是在形状和排列上趋于整齐和规则。由图4-20和图4-26的软骨细胞可见，软骨细胞在形成开始时，两个细胞距离较近，占据同一个陷窝，被称为同源细胞组，随着一些基质的分泌，软骨细胞发生分离。由图4-27可见，软骨细胞较长，细胞质中含有大量的线粒体。细胞外基质中含有大量细小的II型胶原纤维。图4-25为10天斑马鱼脊髓区的光滑内质网（SER）。在内质网周围有大量的空腔，环形内质网中包围着细胞质。根据有关报道，光滑内质网主要起着降解的作用，所以从图4-25也可看到，在光滑内质网存在的区域细胞已死亡。可见，光滑内质网在细胞更替中起着降解细胞质的作用。从图4-18，图4-28和图4-29中，我们可以看到大量的线粒体（M）。线粒体主要为细胞提供能量。在间叶细胞期、脊索区、软骨细胞期都有大量的线粒体存在，说明在细胞分化和类型转变过程中需要大量的能量。由以上讨论可见，在软骨分化和发育过程中，囊泡和线粒体、内质网起着重要的作用。第五章 结论本实验主要利用光学显微镜和JEOL 100-CX透射电镜，对2天、3天、6天、10天的斑马鱼进行了观察研究。主要讨论了斑马鱼脊椎软骨的发育进程，以及软骨细胞特别是脊索旁软骨的排列，形貌，大小及其显微结构特点和中胚层分化的显微形貌。主要得出以下结论：1. 斑马鱼脊椎软骨在配卵后23天开始发育，围绕在脊索周围，并逐渐向神经管和血管方向延伸。斑马鱼脊椎软骨沿体节发育，在1个半月左右的时间，软骨组织的分化基本完成。2. 斑马鱼的软骨组织排列较为整齐，脊索旁软骨末端和头部软骨细胞为单排排列。大多数软骨细胞大小在520m范围内。斑马鱼的软骨组织为透明软骨，胞外基质含量较少，主要为II型胶原纤维。3. 在TEM的观察中发现，斑马鱼的肌肉组织分化较早，在3天已基本分化完成。而体干部的脊索旁仍为中胚层的间叶细胞，为软骨细胞的原基。4. 中胚层间叶细胞的细胞核很大，在分化成软骨细胞的过程中，首先是在形状和排列上趋于整齐和规则。5. 斑马鱼的骨化方式为软骨骨化。软骨细胞的细胞质中富含大量的内质网和线粒体，在细胞的分化和更替过程中分别起着降解细胞质和提供能量的作用。在细胞质中还有大量直径为100-400nm的囊泡，推测囊泡对基质的输运和新组织的形成有着重要的作用。6. 脊髓处的细胞的细胞核较大，细胞质含量很少，有别于软骨细胞。并且该处细胞有部分死亡，被其它细胞取代。参考文献1. Miyake.T,Hall.BK.(1994). Development of in-Vitro Organ-Culture Techniques for Differentiation and Growth of Cartilages and Bones from Teleost Fish and Comparisons with in-Vivo Skeletal Development.Journal of Experimental zoology.268,22-43.2. Kimmel.CB,Ballard.WW,Kimmel.SR,Ullmann.B,Schilling.TF.(1995). Stages of Embryonic-Development of the Zebrafish.Developmental Dynamics.203,253-310. 3. Charles B.Kimmel ,Craig T.Miller ,Greg Kruze ,Bonnie Ullmann.(1998).The Shaping of Pharyngeal Cartilages during Early Development of the Zebrafish .Dev.Biol.203,245-263.4. Tohru Suzuki ,Tadahide Kurokawa.(1996).Functional Analyses of FGF during Pharyngeal Cartilage Development in Flounder (Paralichthys olivaceus)Embryo.Zoological Science.13,883-891.5. 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