第四章 发酵机制及控制.ppt

第四章发酵机制与代谢控制 自然发酵 产品大都是微生物自身不能够再利用的代谢物质 通过对环境的控制 来提高其产量和产率 代谢控制发酵 产品多为代谢中间物质或者要进一步转化的物质 不但需要严格的控制环境 通常还需要对其代谢机制有系统地了解 4 1糖的代谢与调节 本节主要介绍糖代谢的几条代谢途径 和其调节机制 并简单介绍糖代谢厌氧发酵产物乙醇的发酵生产 一 糖代谢的途径糖代谢的主要途径有 1 糖的酵解途径 EMP途径2 TCA循环3 HMP途径 磷酸戊糖途径 4 ED途径 1 糖的酵解途径 EMP途径 其产物是 丙酮酸丙酮酸有氧氧化生成 乙酰辅酶A丙酮酸无氧代谢 脱羧 生成乙醛 乙醛还原生成乙醇 2 TCA循环 丙酮酸在有氧的条件下 在丙酮酸氧化脱羧酶系 脱氢酶 的作用下 氧化脱羧生成乙酰辅酶A CH3 CO SCoA 进入TCA循环 彻底氧化成CO2和H2O 总的反应式 C6H12O6 6CO2 6H2O 32ATP TCA一圈 即每分子乙酰辅酶A氧化 有 2 5ATP 3 1 5 1 2 5总计 2 2 5ATP 3 1 5 1 2 5 2 5 2 2 32ATP 将葡萄糖彻底氧化成CO2和H2O 并有29分子的ATP生成特点 1 中间代谢产物中有 C7 C5 C4有利于微生物的合成代谢 2 只有NADP参入氧化脱氢反应 可以产生大量的NADPH 3 是一条高产能的氧化途径 反应式 C6H12O6 6CO2 6H2O 29ATP 3 HMP途径 磷酸戊糖途径 常见的是细菌的ED途径 发酵生产乙醇 反应式 C6H12O6 2丙酮酸 2TP NADPH NADH例如 在谷氨酸发酵中 菌体生长期 EMP HMP 38 GA合成期 EMP HMP 26 4 ED途径 1 糖代谢的能荷调节能荷 ATP 1 2 ADP ATP ADP AMP 显然 能荷在0 1之间糖原 葡萄糖 产生ATP关键酶 G磷酸化酶磷酸果糖激酶 PFK 异柠檬酸脱氢酶柠檬酸合成酶因此 能荷对糖代谢的调节是方向性的 二 糖代谢的调节机制 2 生物素的调节生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的 后者是对糖代谢流的调节 而生物素的主要作用是对糖降解速率的调节 通常生物素能够促进糖的EPM途径 对TCA循环也有促进作用 对糖的HMP途径也有促进作用 但是 对上述三条途径的促进作用的大小却不同 对EMP途径的促进作用较大 3 磷酸盐的调节作用三 酵母菌的酒精发酵生产简介 4 2酵母菌的甘油发酵 一 行业简介1 应用化工领域 环氧氯丙烷 改性醇酸树脂 酚醛树脂等医药工业 添加剂 润滑剂等食品工业 甜味剂 保湿剂 对风味也有独特的影响在造纸 皮革 玻璃 化妆品等行业 约1700多种产品需要 2 生产方法 1 天然油脂为原料 天然油脂肥皂 废水回收甘油原烟台第二化工厂生产军用甘油 其副产品 2 以丙烯为原料合成壳牌的氯化法 过乙酸法 3 发酵法甘油生产 厌氧发酵 好氧发酵 3 我国发酵甘油在技术上与国外主要存在以下差距 1 残糖高 2 规模化较少 4 我国甘油市场的构成与西方发达国家相比也有较大的差异 中国 涂料 49 医药食品 10 美国 涂料 10 医药食品 54 以上 二 甘油的厌氧发酵 1 酵母菌代谢合成机制 1 6 二磷酸果糖 2 亚硫酸盐法甘油发酵 酵母菌在酒精发酵时 如加入亚硫酸氢钠等盐类 它能与乙醛起加成作用 生成难溶的结晶状亚硫酸纳加成物 这样就使乙醛不能作为受氢体 而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体 在 磷酸甘油脱氢酶 NAD为辅酶 催化下生成 磷酸甘油 后者在 磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成 甘油 CH2OHOH C6H12O6 NaHSO3 CHOH CH3 C OSO2Na CO2 CH2OHOH 3 碱法甘油发酵 双分子歧化反应乙醛 乙醛 乙醇 乙酸则 NADH没有受体 使得菌体的代谢流转向合成甘油的方向进行 从而生产大量的甘油 4 厌氧甘油发酵的能量和转化率的问题 以葡萄糖为原料的甘油的厌氧发酵 产率不可能突破50 的转化率 5 厌氧甘油发酵的缺点 1 碱性条件 无能量产生 导致菌体死亡率较高 2 转化率较低 三 甘油的好氧发酵 在甘油发酵过程中通风 以减少酵母细胞的死亡率 另一方面 在适当的氧的存在下 酵母细胞可以进行有限的有氧代谢 为其自身的生长提供必需的ATP 这种有限的好氧发酵 使得丙酮酸进行TCA循环的同时 也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物 对于甘油的提取带来了不利的影响 4 3柠檬酸发酵机制与代谢调控 一 行业简介1 我国的柠檬酸发酵采用的菌种 黑曲霉 具有双重功能 2 尽管采用边糖化边发酵的工艺 但发酵周期只有64小时 3 柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平 平均产酸速率是国外的2倍 葡萄糖丙酮酸 丙酮酸乙酰辅酶A CH3CO CoA CO2固定反应草酰乙酸 柠檬酸合成酶 柠檬酸 二 柠檬酸的生物合成途径用图示之 特点 顺乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱三 柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制1 磷酸果糖激酶 PFK 活性的调节研究表明 微生物体内的NH4 可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用 在较高的NH4 的浓度下 细胞可以大量形成柠檬酸 那么NH4 浓度是如何升高的呢 Mn2 缺乏如何会使NH4 浓度升高呢 外源氮源分解产生氨基酸 菌体生长合成蛋白质 氨基化合成氨基酸 消耗NH4 2 顺乌头酸酶活性的控制该酶的丧失或失活是阻断TCA循环 大量生成柠檬酸的必要条件 通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱 但在发酵过程中仍需要控制它的活性 由于该酶的活性受到Fe2 的影响 控制培养基中的Fe2 的浓度 可以使该酶失活 但是在柠檬酸发酵过程中 培养基中的Fe2 的浓度有要求不能够低于0 1mg L 原因目前尚没有搞清楚 3 能荷调节对柠檬酸发酵的影响侧系呼吸链 NAD P H经过该呼吸链 可以正常的传递H 将其氧化为H2O 但是并没有氧化磷酸化生成ATP 能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链 只长菌不产酸 四 柠檬酸发酵的产率1 无CO2固定反应的产率192 180 1 5 71 1 2 通过CO2固定反应提供C4二羧酸192 180 106 6 C6H12O6C6H8O7 C没有增加 可见 CO2固定反应堆与柠檬酸发酵的重要性 在柠檬酸产生菌内 存在下列CO2固定反应1 磷酸烯醇式丙酮酸 CO2 草酰乙酸 C4二羧酸 酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2 丙酮酸 CO2 草酰乙酸 C4二羧酸 酶 丙酮酸羧化酶以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素 在柠檬酸发酵过程中 存在三个控制要点 1 点 EMP畅通无阻控制Mn2 NH4 浓度升高 解除柠檬酸对PFK的抑制 防止侧系呼吸链失活 2 点 通过CO2固定反应生成C4二羧酸 强化这一反应的方法和意义 生物素 锰离子 镁离子 罐压等 3 点 柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低 方法 控制培养基中的Fe2 的浓度 五 柠檬酸产生菌的育种1 透明圈大的菌株平板 10 甘薯 2 的琼脂 0 5 CaCO3诱变后 涂布 透明圈大的则好 为何 淀粉的水解能力 2 显色圈大小平板 麦汁培养基 pH值指示剂诱变后 33 培养3天 显色圈大的则好 3 不分解柠檬酸的菌株不利用柠檬酸为碳源进行生长的菌株 说明其TCA循环中柠檬酸后述的酶的活性较低 或者丧失 这有利于柠檬酸的积累 方法 以柠檬酸为唯一的碳源的培养基上 选择生长不好的突变株 4 选育不长孢子 少长孢子 迟长孢子的菌株在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸 自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低 这样不利于孢子的形成 4 4GA的生物合成机制与代谢调节 一 GA的生物合成途径二 GA生物合成的内在因素三 GA生物合成的最理想途径与转化率四 生物素在GA发酵中的作用五 细胞膜通透性的调节六 GA发酵的外在因素七 GA发酵生产中的异常现象及其处理 一 GA的生物合成途径 1 EMP 丙酮酸 ATP NADH 2 HMP 6 磷酸果糖3 磷酸甘油酸NADPH 酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体 3 TCA循环 生成谷氨酸前体物质 酮戊二酸 4 CO2固定反应 补充草酰乙酸 5 乙醛酸循环 使琥铂酸 延胡索酸和苹果酸的量得到补充 维持TCA循环的正常运转 谷氨酸脱氢酶 6 还原氨基化反应 酮戊二酸 谷氨酸 谷氨酸的生物合成模式 二 GA生物合成的内在因素 产生菌的生化特点 1 KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失2 GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失3 产生菌体内必须有乙醛酸循环 DCA 的关键酶 异柠檬酸裂解酶 4 菌体有强烈的L 谷氨酸脱氢酶活性 KGA NH4 NADPH GA NADP反应机制如下 三 GA生物合成的最理想途径与转化率 1 在前述GA合成所必需的条件的基础上 封闭乙醛酸循环 体系不存在CO2固定反应 则有 则有 3 2C6H12O6 NH4 C5H9O4 4CO2 来自何方 产率 147 180 3 2 54 4 2 在前述GA合成所必需的条件的基础上 封闭乙醛酸循环 存在CO2固定反应 则有 C6H12O6 NH4 C5H9O4 CO2 来自何方 产率 147 180 81 7 在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径 1 磷酸丙酮酸羧化酶的作用下磷酸丙酮酸 CO2 GTP 草酰乙酸 GDP 2 苹果酸合成酶的作用下丙酮酸 CO2 NADH 苹果酸 NAD上述反应需要Mg2 Mn 做催化剂 所以 在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn 四 生物素在GA发酵中的作用 1 生物素对发酵液pH值的影响2 乙醛酸循环的封闭DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶 研究表明 该酶受以下几个因素的影响 为醋酸诱导受琥珀酸的阻遏 其活性受琥珀酸的抑制 当VH缺乏时 1 丙酮酸的有氧氧化就会减弱 由于VH对TCA循环的促进作用 则 乙酰辅酶A的生成量就会少 醋酸浓度降低 它的诱导作用降低 2 VH对TCA循环的促进作用的降低 使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低 其浓度得到积累 这样它的阻遏和抑制作用加强 两者综合的作用使得 异柠檬酸裂解酶的活性丧失 DCA循环得到封闭 3 生物素对菌体生长的促进作用 一方面提供了大量的 中间性产物 菌体增殖的物质基础另一方面 菌体的能和水平得到提高 菌体增殖的能量的保证以上分析说明 GA发酵过程中 前期 菌体的增殖期 一定的量的生物素是菌体增殖所必需的 而在产物合成期 则要限制生物素的浓度 以保证产物的正常合成 五 菌体细胞膜渗透性的调节与控制 意义 细胞膜渗透性的调节对于GA发酵时非常重要的 正如前述 当菌体进入产物合成期时 开始有GA的产生 这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外 可以解除GA对L 谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用 从而实现由Glucose GA的高效率转化 反之 如果 控制细胞膜的渗透性的途径 1 通过生理学手段控制细胞膜渗透性 2 通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性 1 VH对菌体细胞膜渗透性的影响 脂肪酸 甘油磷酸磷脂 蛋白质生物膜因此 脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分 生物素限量 不利于脂肪酸的合成 有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外 其中 将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶 该酶的辅酶是VH VH在此反应过程中起到传递CO2的作用 当培养基中VH的浓度较低时 细胞膜的合成就会受影响 92 培养基中生物素限量时 胞内AA 胞外12 培养基中生物素丰富时 胞内AA 胞外 2 使之合成不完整的细胞膜 造成膜的缺损 提高细胞膜的渗透性甘油 油酸营养缺陷型的选育3 青霉素的使用抑制肽聚糖合成中的转肽酶的活性 引起肽聚糖结构中肽桥无法交联 造成细胞壁缺损 在膨胀压的作用下代谢物外渗 从而提高细胞膜的渗透性4 表面活性剂等 六 GA发酵的外在因素 1 培养基成分 主要是玉米浆2 供氧浓度过量 NADPH的再氧化能力会加强 使 KGA的还原氨基化受到影响 不利于GA的生成 供氧不足 积累大量的乳酸 使发酵液的pH值下降 不利于GA的产生 同时 一部分葡萄糖转成了乳酸 影响了糖酸转化率 降低了产物的提出率 3 NH4 浓度 1 影响到发酵液的pH值 2 与产物的形成有关 过低 不利于 KGA的还原氨基化 过高 产生谷氨酰胺 在谷氨酰胺合成酶的作用下 谷氨酰胺的缺点 NH4 的供给方式 1 液氨 2 流加尿素 条件和优缺点 副反应 4 磷酸盐 不足 过量 1 促进EMP途径 打破EMP与TCA之间的平衡 积累丙酮酸 产生乳酸等 2 产生并积累Val 带来的问题是 1 可以抑制葡萄糖 丙酮酸 进而使GA的生物合成受到阻止 2 消耗了丙酮酸 降低了糖酸转化率 3 发酵液中的Val存在 严重的影响GA的结晶 提出 焦磷酸硫胺素 TPP 5 金属离子 1 Mg2 2 Mn2 七 GA发酵生产中的异常现象及其处理 1 发酵前期pH值过高危害 影响因素 1 耗糖速度过慢 就是糖的代谢速度过慢 2 初脲量大 菌种脲酶活力高导致铵离子浓度高 3 前期感染phqge 4 培养基中缺乏磷酸盐等 处理方法 1 耗糖速度慢 通过测定糖的含量确定 可以强化通风 适当添加生物素等 2 初脲量大 停止通风 或者小通风 以使尿素缓慢释放铵离子 3 感染phqge 4 缺乏磷酸盐 2 初期pH值偏低 1 初脲添加量不够 提前酌情流加尿素 2 跑尿 3 培养基中的磷酸盐过高 代谢平衡被打破 酸性产物的积累 4 供氧不足 3 接种后菌体生长不良 OD值偏低 耗糖速度缓慢 危害 发酵周期长 菌体活力低 糖酸转化率偏低 1 可能感染phage 2 培养基存在问题 缺乏生物素缺乏磷酸盐存在抑制性物质 淀粉水解产生的抑制性物质 培养基灭菌产生的 3 通风量过大 溶氧水平高 使得菌体耗糖速度降低 能荷的问题 4 种子不良 种子衰老 接种温度过高 导致菌体被烫死 5 前期通风较少 pH值偏低 代谢产物积累较多的酸性物质 不利于菌体的生长 4 中后期 OD值继续升高 好糖快 但是产酸很低 危害 生生产上说的 只长菌 不产酸产生原因 1 生物素浓度过高 2 可能是感染了杂菌镜检初步判断是否感染了杂菌 5 发酵中后期pH值低 耗糖快 但是产酸低或者不产酸 1 可能是感染了杂菌 上述情况 2 供氧不足 导致酸性产物的积累 3 生物素浓度过高 磷酸盐浓度过高 导致OD值增长太快 这些都是菌体大量增殖的有利条件 处理方法 大量的通风 提前流加尿素 迅速提升发酵液的pH值 6 发酵过程中发酵液泡沫太多 危害 1 淀粉质量差 杂质多 蛋白质含量高 2 糖化不完全 糖化液中含有糊精 3 糖化工艺不合理 复合物形成过多 4 可能是感染杂菌 5 泡敌选择不理想 7 发酵过程中 产酸后 GA又下降危害 原因 1 pH值过高 谷氨酰胺合成酶活性加强 使得GA NH4 谷氨酰胺 2 感染杂菌 8 谷氨酸浓度急剧的增加危害 感染了phage 4 5Lys的生物合成机制与代谢调节 一 行业简介我国的Lys生产与国外的差距主要表现在 1 菌种性能的差异 Lys是菌体代谢过程中的中间性产物 但不是主链上的产物 其生成机制很复杂 对菌种的要求很高 国内菌种的产酸水平为 35 55g L 转化率为 20 25 远低于国外的生产水平 2 提出率较低 3 生产规模较小 二 赖氨酸的生物合成机制 细菌类发酵与酵母菌发酵的比较 优点 1 菌体体积较小 相对增殖所用的底物较少 产率高 2 细菌的繁殖速度快 在合适的生长条件下 其繁殖速度只有几分钟 而酵母的增殖速度最少在一个小时以上 这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件 3 细菌的细胞膜的通透性易于调节 对于胞外产品 可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌 例如 GA的发酵 对于胞内产物 其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎 缺点 1 细菌菌体较小 当需要从发酵液中把菌体分离出来 有利于产物的结晶提出 或产物就是菌体或菌体内的胞内物 细菌比酵母菌难以分离 2 细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格 发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高 这就增加了细菌发酵的生产成本 3 细菌发酵易感染噬菌体 1 大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控 大肠杆菌赖氨酸代谢特点 关键酶 处于分枝代谢的分支点上 对于整个反应起到限速作用的 酶活性往往受到后续产物的反馈抑制的酶 对于赖氨酸的上述代谢途径 天冬氨酸激酶则是一个关键酶 同功酶 催化同一反应 但其活性受不同代谢产物体调节的酶 这种酶往往有多个不同的活性中心 上述代谢途径中 天冬氨酸激酶是一个同功酶 分别受三个代谢产物的抑制 这三个终产物分别是 Lys Met和Thr 只有当这三个代谢产物同时过量时 Asp激酶的活性才能完全被抑制 根据上述代谢特点 要使菌体合成并积累Lys 可以选育Hos 1 既可以解除 天冬氨酸的代谢支路 使代谢流向Lys的方向进行 提高了从底物葡萄糖到产物的转化率 2 更重要的是由于Hos 使得代谢过程中不可能产生过量的Met Thr 尽管产生了大量的Lys Lys可以抑制关键酶 天冬氨酸激酶1 但是天冬氨酸激酶2 3的活性由于Met Thr的限量 并没有受到抑制 也就是说 天冬氨酸 半醛 仍可以大量的生成 这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻 2 黄色短杆菌Lys生物合成的调控 两者代谢区别 1 在黄色短杆菌中 天冬氨酸激酶 AK 仍然是一个关键酶 但是该酶是一个变构酶 有两个活性中心 分别受Lys Thr的协同反馈抑制 协同反馈抑制 该酶往往有多个活性中心 抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合 但是并不影响该酶的活性 只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后 其酶活性才会受到完全抑制 2 黄色短杆菌中 存在两个分支点的优先合成机制 阻遏 当代谢产物过量时 能够对该酶的生物合成起到封闭作用 使得该酶的合成受阻 黄色短杆菌生产Lys 选育Hos 其意义在于 1 解除了Hos的优先合成机制 阻断了代谢向Met Thr的方向进行 节省了原料 可以使Asp 半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上 2 在培养基中限量的供给Met Thr 或者Hos 对于AK酶活性的调节有着重要意义 因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶 限制了其中某一个抑制物 Thr 则Lys的浓度再高 也不会影响到AK酶的活性 那么 代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行 使得产物的合成畅通无阻 脱敏 使该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力 从而解除代谢产物对该酶的反馈抑制或者阻遏作用 如何使其脱敏呢 通常可以采用抗性突变株 选育结构类似物抗性突变株 Xr 1 S L 半胱氨酸抗性突变株AECr 2 甲基赖氨酸抗性突变株MLr 3 L 赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr 4 苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株ThrHxr 4 6次级代谢产物的合成机制与代谢调节 一 基本概念1 初级代谢 是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如 糖 氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如 多糖 蛋白质 核酸等的代谢 称之为初级代谢 那么 这些化合物统称之为 初级代谢产物 2 次级代谢 是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢 这一类的物质统称之为 次级代谢产物 例如 抗生素 激素 某些酶制剂等 3 分叉中间体从下图可以看出 许多物质处于代谢的分叉点上 例如 CH3CO SCoA 是葡萄糖糖经HMP EMP生成的中间物质 经羧化后可形成丙二酰辅酶A 丙二酰辅酶A可用于脂肪酸的合成上 进而又可经多次重复缩合 环化等形成四环类或其他抗菌素等次级代谢产物 而CH3COSCoA又可以进入TCA循环 这类物质称之为 分叉中间体 如 丙酮酸 乙酰辅酶A 草酰乙酸等这些个分叉中间体把微生物的次级代谢和初级代谢紧密地联系起来 4 发酵逆转的概念 发酵中期当微生物群体进入产物合成期时 如果向发酵液中流加氮源或者改变 使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成 这种现象称之为发酵逆转 在次级代谢产物发酵过程中是非常普遍的 具体例子 耐高温 淀粉酶发酵中 流加 G GA 停电等 4 7微生物代谢产物的过量生产 一 提高初级代谢产物产量的方法1 使用诱导物对于许多酶类的发酵 特别是淀粉 蛋白质的水解酶 其大部分是诱导酶 意义 对于这一类的酶类的发酵 向培养基中添加诱导物 可以促进酶的合成与分泌 有利于提高产量 2 选育组成型突变株 诱导机制 目前最清楚的是大肠杆菌的乳糖操纵子 无诱导物 产生有活性的阻遏蛋白 结合到操纵基因上 使NDA中的结构基因不能翻译 蛋白质 酶不能够合成 R 调节