iTRAQ常见问题.docx

2014-10-24 09:12消息引用分享只看楼主推荐上首页1.iTRAQ技术原理是什么？多个（每组最多8个）来源不同的蛋白样品经过不同标签标记后，可以合并后同时进行质谱分析。在每个肽段二级质谱图上，相应每个样品的报告离子强度用以表征该蛋白在不同样品中相对含量的高低，而肽段碎片离子可用于蛋白的鉴定分析。是鉴定与定量同时进行的一种定量技术。2.关于“样品重复”，技术重复和上机重复有什么区别？“样品重复”，也可以称为生物重复。生物重复是指样品来自同一处理组的不同样品，是整个实验的完全重复，如平行培养的细胞或细胞株。技术重复是指对同一生物样品进行重复实验，可降低实验中的测量误差或背景噪音。上机重复是指是指同一样品进行重复上机检测。如下图：具体可参考文献：Chee Sian Gan, PohKuan Chong, etal. Technical, Experimental, and Biological Variations in Isobaric Tagsfor Relatives and Absolute Quantitation (iTRAQ). Journal of Proteome Research.2007; 6(2): 821-827.3.不同老师的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机？不能。因为即使是同一个物种的样品，经过不同实验室处理后，里面蛋白含量和数目会有较大差别，混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。而对于来自不同物种的样品，信息分析的数据库选择会不同，无法进行比较。4.为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？从生物学角度看，由于miRNA调控、蛋白降解、蛋白分泌、转录和翻译效率不一致等原因，导致蛋白水平和转录水平未必呈现一样的趋势，这是正常现象。如果这些差异基因恰恰是老师感兴趣的，我们建议针对这些目标蛋白用MRM方法做一下“目标蛋白分析”，如果老师已有相关的研究基础，也可以用抗体的方法验证。因为当我们的研究视角落到一定范围内的时候，高通量的结果也需要进一步的仔细验证。5.数据分析中主要看哪些参数？对于液质联用的数据分析，一般观察的参数为：TotalIon Score C.I. %（可信度）和Tag-80/Tag-0（两样本的比值）。6.两样本的比值都代表什么？两样本的比值如果在0.9-1.1之间的，可以认为两样本的含量是一样的，即比值为1：1；而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。7.质谱图中显示的是各种蛋白吗？不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱，由于质谱法是电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量，由此来确定离子的化合物组成。8.液质联用是不是可以检测所有蛋白？原则上讲是这样的，如果单个蛋白在所提供的样本中的含量少于100ng可能就检测不出来了，总体上样量为50-100g，一般每次可以检测出来的蛋白数量从几百到几千都有可能，取决于标本本身的情况。9.提供的结果除了分析数据外，是不是包括蛋白名称还是蛋白的大致归类？给出的是蛋白的名称，按照可信度从大到小排列。10.是否还有每个蛋白的鉴定图谱或者提供蛋白结果分析?没有每个蛋白的鉴定图谱，图谱是肽段。11.差异蛋白试验的结果包括哪些呢？存在差异的蛋白种类，名称，肽段序列，分子量，pI或者有否其他的什么信息，结果是以什么形式进行呢？表格或图片？差异蛋白试验的结果包括：ProteinName、Species、AccessionNumber、ProteinMW、ProteinPI、TotalIon Score、L/N；结果以表格形式提供。12.对实验的样品有什么要求？或者你们是否可以帮忙处理样品？若蛋白由您提供给我们，总蛋白量至少500g；或者您直接提供组织、细胞或菌体给我们，蛋白由我们来抽提。13.是否可以提供蛋白序列？由于检测出的蛋白数量很多，都是成百上千个，iTRAQ机器不可能将检测出的每种蛋白序列都提供给您，这个工作量非常大，而且也不是每一个检测出来的蛋白对您都有意义，一般可以先提供结果，您选择研究有意义的蛋白名称，我们可以提供相应蛋白肽段给您。14.若使用iTRAQ实验，提供的样品量需要多少？细胞样品：贴壁细胞：贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；每瓶细胞加3 ml 4度遇冷的PBS（0.01 M，pH7.2-7.3），平放摇动洗涤细胞1min，重复3次；空干PBS后，放入干冰或-80冰箱中保存。悬浮细胞：悬浮细胞培养或处理结束后，离心（1500g，4离心10min）去除培养液；放入干冰或-80冰箱中保存。细胞数据量要求：建议5*10e7，最低要求为1*10e7。外周血样品：至少2 ml EDTA抗凝的外周血样品，-80冰箱中保存不超过1年；如果是血清，要求至少500 l血清，-80冰箱中保存不超过1年；如果用于细胞因子的ELISA或者流式检测，避免使用EDTA抗凝，可以选择肝素钠抗凝。组织样品：至少100 mg动物或人体组织，收取后迅速冷冻于-80冰箱中保存，不超过2年。植物样品：至少1 g植物组织，如果是成熟叶片、成熟根部、茎秆，要求至少5 g植物组织，用液