安全生产_食品安全分析课件

第十章维生素的测定 海南大学食品学院 第一节概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物 其种类很多 目前已确认的有30余种 其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种 人体如从膳食中摄入维生素的量不足或者机体由于某种原因吸收或合成发生障碍时 就会引起各种维生素缺乏症 近几年已经查明仅有少数几种维生素可以在体内合成 大多数维生素都必须由食物供给 维生素的分类 1 脂溶性维生素 能溶于脂肪或脂溶剂 在食物中与脂类共存的一类维生素 包括A D E K 其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中 不能从尿中排除 大剂量摄入时可能引起中毒 由于可储藏在脂肪中 故不需每天供给 2 水溶性维生素 能溶于水 包括B族 C 其共同特点是一般只存在于植物性食品中 满足组织需要后都能从机体排出 需要每天供给 测定食品中维生素的含量的意义 评价食品的营养价值 寻找富含维生素的食品资源 指导人们合理调整膳食结构 防止维生素缺乏症或维生素中毒 研究维生素在食品加工 贮存等过程中的稳定性 指导人们制定合理的工艺及贮存条件 监督维生素强化食品的强化剂量 防止因摄入过多而引起维生素中毒 第二节脂溶性维生素的测定 VA VD VE VK与类脂物一起存于食物中 脂溶性维生素具有以下理化性质 1 溶解性 不溶于水 易溶于脂肪 乙醇 丙酮 氯仿 乙醚 苯等有机溶剂 2 耐酸碱性 VA VD对酸不稳定 对碱稳定 VE对碱不稳定 但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下 也能经受碱的煮沸 3 耐热性 耐氧化性 耐热性好 VA易被氧化 光和热促进其氧化 VE易被氧化 对可见光稳定但易被紫外光氧化 VK易被光 氧化剂及醇氧化 根据上述性质 测定脂溶性维生素时 通常 皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素 不皂化物 浓缩溶于适当的溶剂测定 在皂化和浓缩时 为防止维生素的氧化分解 常加入抗氧化剂 如焦性没食子酸 维生素C等 一 维生素A的测定 维生素A存在于动物性脂肪中 主要来源于肝脏 鱼干油 蛋类 乳类等动物性食品中 植物性食品中不含VA 但在深色果蔬中含有胡萝卜素 它在人体内可转变为VA 故称为VA原 GB T5009 82 2003中第一法高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法 此法能快速分离 同时测定维生素A和维生素E 最小检出量分别为VA 0 8ng E 91 8ng E 36 6ng E 20 6ng 一 高效液相色谱法测定食物中VA VE 1 原理食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后 将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中 用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量 2 分析步骤皂化 提取 洗涤 萃取 浓缩 溶解 离心 测定 结果计算 1 皂化称取1 10g样品 含维生素A约3 g 于皂化瓶中 加30mL无水乙醇 进行搅拌 直到颗粒物分散均匀为止 加50mL10 抗坏血酸 苯并 e 芘标准液2 00mL 混匀 加10mL 1 1 氢氧化钾 混匀 于沸水浴上回馏30min使皂化完全 皂化后立即于水中冷却 2 提取将皂化后的样品移入分液漏斗中 用50mL水分2 3次洗皂化瓶 洗液并入分液漏斗中 用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣 乙醚液并入分液漏斗中 如有残渣 可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗 轻轻振摇分液漏斗2min 静置分层 弃去水层 3 洗涤用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层 水洗至水层不显碱性 最初水洗轻摇 逐次振摇强度可增加 4 浓缩将乙醚提取液经过无水硫酸钠 约5g 滤入与球形蒸发瓶内 用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次 入蒸发瓶内 并将其接至旋转蒸发器上 于55 C水浴中减压蒸馏并回收乙醚 待瓶中剩下约2mL乙醚时 取下蒸发瓶 立即用氮气吹掉乙醚 加入2 00mL乙醇 充分混合 溶解提取物 将乙醇液移入一小塑料离心管中 离心5min 5000rpm 上清液供色谱分析 5 标准曲线的制备将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液 约1mg mL 制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度 标准浓度的标定方法 取维生素A和维生素E标准液若干微升 分别稀释至10 00mL乙醇中 并分别按给定波长测定各维生素的吸光值 用比吸光系数计算该维生素的浓度 绘制标准曲线 标准和内标物进行色谱分析 以维生素A峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标 维生素A浓度为横坐标绘制标准曲线 6 高效液相色谱分析预柱 ultrasphereODS10 m 4mm 4 5cm分析柱 ultrasphereODS5 m 4 6mm 25cm流动相 甲醇 水 98 2混匀 于临用前脱气紫外检测器波长 300nm进样量 20 L流速 1 7mL min 7 注意事项维生素A极易被破坏 实验操作应在微弱光线下进行 或用棕色玻璃仪器 在皂化过程中 应每5分钟摇一下皂化瓶 使样品皂化完全提取过程中 振摇不应太剧烈 避免溶液乳化而不易分层 洗涤时 最初水洗轻摇 逐次振摇强度可增加 无水硫酸钠如有结块 应烘干后使用 在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干 以免被测样品含量损失 用高纯氮吹干时 氮气不能开的太大 避免样品吹出瓶外结果偏低 GB T5009 82 2003中第二法原理 在氯仿溶液中 VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物 在620nm波长处有最大吸收峰 其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比 故可比色测定 适用范围及特点 本法适用于维生素A含量较高的各种样品 高于5 10 g g 对低含量样品 因受其他脂溶性物质的干扰 不易比色测定 主要缺点 生成的蓝色络合物的稳定性差 比色测定必须在6秒钟内完成 否则蓝色会迅速消退 将造成极大误差 二 比色法测定VA的含量 注意 维生素A见光易分解 整个实验应在暗处进行 防止阳光照射 或采用棕色玻璃避光 三氯化锑腐蚀性强 不能沾在手上 三氯化锑遇水生成白色沉淀 因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗 二 胡萝卜素的测定 GB T5009 83 2003 第一方法是HPLC 第二方法为纸层析法 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素 有多种异构体和衍生物 总称为类胡萝卜素 其中在分子结构中含有 一紫罗宁残基的类胡萝卜素 在人体内可转变为维生素A 故称为维生素A原 如 胡萝卜素 其中以 胡萝卜素效价最高 胡萝卜素原只存在于植物性食品中 但以胡萝卜为食物的家禽 兽类 水产动物及其加工产品 以及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素 胡萝卜素的结构如下 胡萝卜素对热及酸 碱比较稳定 但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏 因系脂镕性维生素 故可用有机溶剂从食物中提取 胡萝卜素本身是一种色素 在450nm波长处有最大吸收 故只要能完全分离 便可定性和定量 在植物体内 胡萝卜素经常与叶绿素 叶黄素等共存 在提取 一胡萝卜素时 必须将胡萝卜素与其它色素分开 常用的方法有纸层析 柱层析和薄层层析法 净化用层析介质采用氧化镁 氧化铝避光 三 维生素D的测定 维生素D为固醇类衍生物 具抗佝偻病作用 其中最重要的是D2和D3 植物不含维生素D 但维生素D原在动 植物体内都存在 植物中的麦角醇为维生素D2原 经紫外照射后可转变为维生素D2 又名麦角钙化醇 人和动物皮下含的7 脱氢胆固醇为维生素D3原 在紫外照射后转变成维生素D3 又名胆钙化醇 以D3为最重要 维生素D2药片吃多了中毒 分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法 是AOAC选定的正式方法 维生素D的结构 原理在三氯甲烷溶液中 维生素D与三氯化锑结合生成一种黄色化合物 呈色强度与维生素D含量呈正比 食品中维生素D含量较低 其他维生素严重干扰其测定 因此测定前必须经柱层析除去干扰成分 层析介质为硅藻土 中性氧化铝此法测定的是维生素D2和维生素D3的总量 一 三氯化锑比色法 二 液相色谱法 灵敏度较比色法高30倍以上 且操作简便 精度高 分析速度快 是目前分析维生素D的最好方法 试样经皂化后 用苯提取不皂化物 蒸馏除苯 先采用反相C18柱分取维生素D 除去大部分杂质 进一步采用正相色谱分离 紫外检测定量 反相色谱条件色谱柱 NucleosilC18 7 5mm 300mm流动相 乙腈 甲醇 1 1 流速 2 0mL min紫外检测波长 254nm正相色谱条件色谱柱 正相柱ZorbaxSIL 4 5mm 250mm流动相 0 4 异丙酮的己烷溶液流速 1 6mL min紫外检测波长 254nm 注意事项1 VD2与VD3分不开2 皂化时加入焦性没食子酸作为抗氧化剂2 标样与试样在同样条件下皂化 消除了VD的热异性化损失 3 也可用硅藻土及皂土柱层析 除去甾醇 VA 胡萝卜素的干扰 第三节水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1 B2和C 广泛存在于动植物组织中 饮食来源充足 但是由于它们本身的水溶性质 除满足人体生理 生化作用外 任何多余量都会从小便中排出 为避免耗尽 需要经常由饮食来提供 水溶性维生素都易溶于水 而不溶于苯 乙醚 氯仿等大多数有机溶剂 在酸性介质中很稳定 既使加热也不破坏 但在碱性介质中不稳定 易于分解 特别在碱性条件下加热 可大部分或全部破坏 它们易受空气 光 热 酶 金属离子等的影响 维生素B2对光 特别是紫外线敏感 易被光线破坏 维生素C对氧 铜离子敏感 易被氧化 根据上述性质 测定水溶性维生素时 一般都在酸性溶液中进行前处理 维生素Bl B2盐酸水解酶解提取纯化维生素C通常采用草酸 草酸 醋酸 偏磷酸 醋酸溶液直接提取 在一定浓度的酸性介质中 可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用 草酸价廉 使用方便 对维生素C有很好 一 维生素B1的测定 维生素B1又名硫胺素 抗神经炎素 通常以游离态 或以焦磷酸酯形式存在于自然界 在酵母 米糠 麦胚 花生 黄豆以及绿色蔬菜和牛乳 蛋黄中含量较为丰富 分析方法 GB T5009 84 2003中唯一的方法是荧光计法此法检出限0 05 g 1 原理硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素 噻嘧色素 在紫外线下 硫色素发出荧光 在给定的条件下 以及没有其他物质干扰时 此荧光强度与硫色素量成正比 即与溶液中硫胺素量成正比 从而测定其含量 2 分析步骤制样 水解 净化 氧化 干燥 测定 结果计算 1 提取精确称取一定量试样5 20g 硫胺素含量约为10 30ug 置于100mL三角瓶中 加入50 75mL0 1mol L或0 3mol L盐酸使其溶解 瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解10 3 104Pa30min 凉后取出 用2mol L乙酸钠调其pH值为4 5 以0 04 溴甲酚绿为指示剂 按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶 于45 50 温箱过夜保温 约16h 冷至室温 定容至100mL 然后混匀过滤 即为提取液 2 净化用少许脱脂棉铺于层析柱的底部 加水将棉纤维中气泡排出 再加约1g活性人造沸石使之达到交换柱的三分之一高度 保持层析柱中液面始终高于活性人造沸石 用移液管加入提取液20 80mL 使通过活性人造沸石的硫胺素总量约为2 5 g 加入约10mL热水冲洗交换柱 弃去洗液 如此重复三次 加入25 酸性氯化钾 温度为90 左右 20mL 收集此液于25mL刻度试管内 冷至室温 用25 酸性氯化钾定容至25mL 即为试样净化液 将20mL硫胺素标准使用液加入交换柱以代替样品提取液 即得到标准净化液 3 氧化将5mL试样净化液分别加入A B两个反应瓶 在避光暗环境中将3mL15 氢氧化钠加入反应瓶A 振摇约15s 然后加入10mL正丁醇 将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B 振摇约15s 然后加入10mL正丁醇 将A B两个反应瓶同时用力振摇 准确计时1 5min 重复1 2 用标准净化液代替试样净化液 用黑布遮盖A B反应瓶 静置分层后下层碱性溶液 加入2 3g无水硫酸钠使溶液脱水 4 荧光强度的测定荧光测定条件 激发波长365nm 狭缝5nm 发射波长435nm 狭缝5nm 依次测定下列荧光强度 试样空白荧光强度 试样反应瓶A 标准空白荧光强度 标准反应瓶A 试样荧光强度 试样反应瓶B 标准荧光强度 标准反应瓶B 二 维生素B2的测定 维生素B2即核黄素 在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在 膳食中的主要来源是各种动物性食品 其中以肝 肾 心 蛋 奶含量最多 其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜 分析方法 GB T5009 85 2003中第一法为荧光法 第二法为微生物法 1 原理核黄素在440 500nm波长光照射下发生黄绿色荧光 在稀溶液中 荧光强度与核黄素浓度成正比 在波长525nm下测定其荧光强度 试液再加入低亚硫酸钠 Na2S2O4 将核黄素还原成无荧光的物质 然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度 两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度 2 操作步骤样品均制 水解 过滤定容 氧化去杂质 净化 测定 结果计算 1 水解 称取2 10g样品 约含10 200ug核黄素 于100ml三角瓶中 加入50mL0 1mol L盐酸 搅拌直至颗粒分散均匀 用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口 置于高压锅内高压水解 10 3X104Pa 15lb in2 30min 水解液冷却后 滴加1mol L氢氧化钠 取少许水解液 用0 04 溴甲酚绿检验呈草绿 pH为4 5 2 酶解 含有淀粉的水解液 加入3ml10 淀粉酶溶液 于37 40 保温16h 含高蛋白的水解液 加入3ml10 木瓜蛋白酶溶液 于37 40 保温16h 过滤上述酶解液定容至100mL 用干滤纸过滤 此提取液在4 C冰箱中保存一周 3 氧化去杂质视样品中核黄素的含量取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液 约含1 10ug核黄素 分别于20mL的带刻度试管中 加水至15mL 各管加0 5mL冰乙酸 混匀 加3 高锰酸钾溶液5mL 混匀 放置2min 使氧化去杂质 滴加3 双氧水溶液数滴 直到高锰酸钾颜色褪掉 剧烈震摇此管 使多余的氧气逸出 4 核黄素的吸附与洗脱核黄素吸附柱 硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱 占柱长1 2 2 3 约5cm 为宜 吸附柱下端用一团脱脂棉垫上 勿使柱内产生气泡 调节流速为60滴 min 过柱与洗脱 将全部氧化后的央液及标准液通过吸附柱后 用约20mL的热水洗去样液中的杂质 然后用5 0mL洗脱液 丙酮 冰乙酸 水 5 2 9 将样品中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中 再用水洗吸附柱 收集洗出液并定容至10mL 混匀后待测荧光 5 测定于激发波长440nm 发射波长525nm 测量样品管及标准管的荧光值 待测品及标准的荧光值测定后 在各管的剩余液 约5 7mL 中加0 1mL20 次亚硫酸钠溶液 立即混匀 在20s内测出各管的荧光值 作为各自的空白值 6 计算X A B C D S m f 100 1000式中 X 样品中含核黄素的量 mg 100gA 样品管荧光值B 样品管空白荧光值C 标准管荧光值D 标准管空白管荧光值f 稀释倍数m 样品的质量 gS 标准管中核黄素的含量 g100 1000 将样品中核黄素量由 g g折算mg 100g的折算系数 三 维生素C的测定 维生素C是一种己糖醛基酸 有抗坏血病的作用 所以又称作抗坏血酸 维生素C广泛存在于植物组织中 新鲜的水果 蔬菜 特别是枣 辣椒 苦瓜 柿子叶 猕猴桃 柑桔等食品中含量尤丰富 维生素C具有较强的还原性 对光敏感 氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸 仍然具有生理活性 进一步水解则生成2 3 二酮古乐糖酸 失去生理作用 根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量 常用的测定方法有 1 2 6 二氯靛酚法 还原型VC 2 2 4 二硝基苯肼法 总VC 3 碘酸法 4 碘量法 5 荧光分光光度法 一 2 6 二氯靛酚滴定法 1 原理还原型抗坏血酸可以还原染料2 6 二氯靛酚 该染料在酸性溶液中呈粉红色 在中性或碱性溶液中呈蓝色 被还原后颜色消失 还原型抗坏血酸还原染料后 本身被氧化成脱氢抗坏血酸 在没有杂质干扰时 一定量的样品提取液还原标准染料液的量 与样品中抗坏血酸含量成正比 2 试剂 1 草酸溶液 称取10g草酸 加水至1000mL 2 草酸溶液 称20g草酸 加水至1000mL 维生素C标准液 准确称20mgVC溶于1 草酸中 并稀释至100mL 吸5mL于50mL容量瓶中 加入1 草酸至刻度 此溶液每毫升含有0 02mgVC 0 02 2 6 二氯靛酚溶液 称取2 6 二氯靛酚50mg 溶于200mL含有52mg碳酸氢钠的热水中 冷却后 稀释至250mL 过滤于棕色瓶中 贮存于冰箱内 应用过程中每星期标