细胞化学染色.doc

细胞化学染色检验前言细胞化学是细胞和化学相结合的一门科学。细胞化学染色是根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法，观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。在病理情况下，血细胞的化学成分可发生改变。因此，细胞化学染色不仅对研究血细胞的代谢活动、生理功能，而且对生理和病理情况下血细胞的化学成分的变化、各种类型血细胞的鉴别、某些血液病的鉴别诊断、疾病的疗效观察以及发病机制的探讨均有重要意义。研究血细胞的化学物质较多，如各种酶类、脂类、糖元、铁等。下面主要介绍血液学中常用的一些细胞化学染色方法。瑞氏染色法：瑞氏染色液的配制：瑞氏染料（粉）1g纯甲醇60ml将染料放在乳钵内加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解得倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直到全部染料溶解及用完甲醇为止。制配好的染液保存于温室中一周便可应用。新鲜配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性，染液储存愈久染色愈好。缓冲液的配制及其作用:1% KH2PO4 (即1g KH2PO4+100ml蒸馏水) 30ml1% Na2HPO4 20ml加蒸馏水至1000ml PH 6.46.8 过氧化物酶染色一、原理： 细胞中的过氧化物酶（POX）分解底物过氧化氢（H2O2）产生新生态氧，后者使联苯胺氧化为联苯胺蓝沉淀而定位于POX活性部位。二、过氧化物酶染色法染液的配制：（1）联苯胺（Benzidine） 0.3g95%乙醇（Ethye alcohol） 99ml36%亚硝基铁氰化钠（Sodium Nitroprusside） 1ml (0.36g+1ml蒸馏水，置于37水浴箱中促溶。)（2）30%mlml过氧化氢溶液： 30%双氧水，吸取一滴约0.05ml放入50ml蒸馏水内，每次用时必须新鲜配制。三、结果判断： 细胞质中有蓝色颗粒的为阳性细胞。四、临床意义：粒细胞中除早期原粒细胞呈阴性反应外，晚期原粒细胞及以后各阶段粒细胞均呈阳性反应，细胞越成熟反应越强。单核系细胞：原单核细胞呈阴性反应，幼单核细胞及成熟单核细胞多呈弱阳性反应。淋巴系巨核系红系细胞均呈阴性反应。POX反应主要用于白血病的鉴别。（一）过氧化物酶染色阳性 急性原粒细胞性白血病（M1、M2型）、急性早幼粒细胞性白血病（M3型）急性粒单细胞性白血病（M4型）、急性单核细胞性白血病（M5型）、急性红白血病（M6型）均可呈阳性反应，阳性率3%。M3型阳性反应最强，M5型反应最弱。（二）过氧化物酶染色阴性 急性淋巴细胞性白血病、急性巨核细胞性白血病（M7型）成阴性反应。阳性率3%。部分M1型、M5a型可呈阴性反应，M6型的幼红细胞成阴性反应。中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色一、原理：细胞内碱性磷酸酶能分解磷酸萘酚AS-BI为磷酸和芳基萘酰胺，后者与重氮盐（固兰BB）偶联，形成不溶性的兰色沉淀物。二、试剂：1、固定液：甲醇（AR）甲醛固定液.配方：45 ml甲醇加5 ml甲醛，混匀，置4冰箱备用。2、 缓冲液（NAP buffer）：1.05g 2-氨基-甲基-1，3丙二醇，加蒸馏水至50ml，再加0.1MHcl10ml,再加蒸馏水至200ml，混匀，放4冰箱备用。3、磷酸萘酚AS-BI贮存液：磷酸萘酚AS-BI30mg，加二甲基甲酰胺0.5ml，放0以下冰箱备用。4、染色应用液：缓冲液5ml，加磷酸萘酚AS-BI贮存液25ml，再加固兰BB 5mg，混匀，使溶解，然后过滤待用。5、复染液：1%核固红溶液。配方：25克硫酸铝加500 ml蒸馏水配成5%硫酸铝。1克核固红加100 ml5%硫酸铝配成1%核固红。三、方法：1、血片或骨髓片自然干燥后，入固定液（4）30秒立即取出，蒸馏水冲洗，晾干。2、在室温下，滴加染色应用液，染色15分钟，自来水冲洗，晾干。3、入1.0%核固红复染液10-15分钟，流水冲洗，晾干镜检。四、结果判定：正常血细胞的染色反应碱性磷酸酶主要存在于中性粒细胞，除巨噬细胞可呈阳性反应外，其他血细胞均呈阴性反应。结果应根据成熟中性粒细胞胞浆内兰色颗粒所占胞浆面积，颗粒大小，颗粒多少及染色强度来判断，阴性为胞浆内无兰色颗粒。1、分级标准：级别兰色颗粒占胞浆面积（%）颗粒大小颗粒多少染色强度+50小小很少微弱-中等+50-80小-中等少等-中等中等-强+80-100中等-大中等-多强+100 中等和大很多（密集、甚至覆于核上）很强2、量的表示：阳性率（%）、积分3、正常值：正常人一般阳性率40%，以“+”阳性反应为主，阳性积分40-100。判定结果时，在油镜下，计数100个成熟的中性粒细胞（包括中性分叶核粒细胞和中性杆状核粒细胞），计算阳性率。分为+，+为1分，+为2分，依次类推，分数乘以各自细胞数，即为总积分。如：+ 10个，+13个，+5个，+2个，则积分为1*10+13*2+5*3+4*2=59分。分级时主要根据染色强弱度来判定。五、临床意义：NAP染色主要用于1 鉴别慢粒及中性粒细胞类白血病反应，前者阳性率及积分值均极低，甚至为零。而后者呈强阳性反应，可达成100，积分值可达400。2 初步鉴别急性白血病类型，急淋时NAP活性多增强，急粒时不增强。3初步鉴别感染的病原体，在急性细菌性感染时NAP阳性反应强，而病毒和寄生虫及结核菌感染时NAP染色结果多在正常范围（一）生理变化：（1）年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。（2）应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。（3）月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。（4）妊娠期的变化：妊娠期23个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。（二）病理性变化：（1） 感染：细菌性感染时，NAP活性显著增高，而球菌感染又比杆菌感染时高。病毒性感染时，NAP活性常无明显变化。因此本法可帮助鉴别细菌性与病毒性感染。（2） 血液病： 慢性粒细胞性白血病时，NAP活性显著降低或为阴性，常为“0”，治疗后病情缓解时，NAP活性恢复正常，急变时NAP活性增高。类白血病反应时，NAP活性明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增高，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。因此本法常用来鉴别慢粒和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一。 急性粒细胞性白血病时，NAP活性减低。急性淋巴细胞性白血病时，NAP活性增高。因此本法可作为鉴别急粒和急淋的方法之一。 急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常。 粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯性细菌性感染增高明显。再生障碍性贫血时，NAP活性增高。阵发性睡眠性血红蛋白尿症时，NAP活性减低。因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿症和再生障碍性贫血的方法之一。真性红细胞增多症时，NAP活性增高。继发性红细胞增多症时，NAP活性无明显变化。因此本法可用来鉴别真性红细胞增多症和继发性红细胞增多症。骨髓增生异常综合症的NAP积分值减低。红细胞内外铁粒染色一、原理：骨髓细胞外铁及有核红细胞中铁粒与亚铁氰化钾作用后，呈普鲁士兰阳性反应。二、试剂：1、4%低铁氰化钾25ml（低铁氰化钾1g+蒸馏水 25ml配成4%低铁氰化钾）2、4%HCL 25ml。（HCL27.8 ml+蒸馏水222.2 ml即4HCL）染色时1、2液混合即可。3、1%核固红(核固红配制时，用5%硫酸铝溶解)25g硫酸铝+500 ml蒸馏水即5%硫酸铝,1g核固红+100ml5%硫酸铝即1%核固红.三、方法：1、干燥血片或骨髓片，用福尔马林37薰蒸固定5分钟水洗(蒸馏水)2、入4%低铁氰化钾盐酸混合液37(先预热20分钟)，置入血片或骨髓片40分钟水洗待干3、入1%核固红复染1520分钟，水洗待干。(蒸馏水)四、结果判定：铁粒幼细胞：胞质内出现兰色颗粒的幼红细胞。环铁粒幼细胞：幼红细胞质内的兰色颗粒在6个以上，并围绕于核周排列成环形者。铁粒红细胞：含有兰色铁颗粒的红细胞。 红细胞外铁：根据铁量的多少以“0”“+”表示，正常人一般为“+” “+”（观察骨髓小粒）“0”：无铁粒可见 “+”：有少数铁粒或偶见到铁小珠 “+”：有铁粒小珠和少数小块“+”：有很多的铁粒小珠和少数铁小块“+”：有很多的铁粒、小珠并有小块红细胞内铁：计数100个有核红细胞，以含铁粒红细胞百分数报告。正常人一般铁粒幼红细胞占40%， 以I、II型为主，无环形铁粒幼红细胞。“+”仅含1个铁颗粒“+”含2-5个铁颗粒“+”含6-9个铁颗粒“+”含10个以上铁颗粒五、临床意义： 1.鉴别缺铁性与非缺铁性贫血：缺铁性贫血时，细胞外铁消失，铁粒幼红细胞减少，平均为3%，因此铁染色可作为诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法。 2.诊断铁粒幼红细胞性贫血：铁粒幼细胞性贫血时，细胞外铁显著增多（+），其所含铁颗粒的数目也较多，颗粒也粗大。因此本染色可作为诊断铁粒幼细胞性贫血的重要方法。出现较多的环形铁粒幼细胞，可占幼红细胞的15%以上。铁染色是诊断铁粒幼细胞性贫血的重要手段。 3. MDS 时，铁粒幼细胞的百分比可增高，其所含铁颗粒的数目可增多，环铁粒幼细胞常见。在铁粒幼细胞难治性贫血，环铁粒幼细胞在15%以上。 4.非缺铁性贫血如巨幼细胞性贫血、溶血性贫血等，细胞外铁可增多，铁粒幼红细胞亦增多。糖元PAS染色一、原理：糖原染色是利用过碘酸雪夫（schiff）反应显示糖元。雪夫氏试剂是利用碱性复（品）红配制的，复（品）红为含有醛基的染料，加入亚硫酸氯钠可将醛基结构破坏，则失去颜色，或为无色溶液，这种试剂是一种有效的醛试剂，用来测定醛基物质。糖原经过高碘酸氧化可产生双醛基，再以雪夫氏试剂进行醛反应，产生紫红色。这种方法可显示糖原的存在，称作：高碘酸雪夫式氏反应。二、试剂：1雪夫式试剂：蒸馏水200ml，煮沸，用玻棒边搅边趁热加入碱性复（品）红1g（schiff） （从电炉取下，缓慢加入）摇匀后，立即过滤至另一干燥瓶中，待凉至60，加入1M Hcl 20ml，再加入亚硫酸氢钠2g，摇匀立即用锡纸包塞紧瓶口，观察滤液透明后，（如不透明则加温，使其透明）于暗处过夜，应是淡茶色，加12勺（先加1勺，看看再加）活性炭末，15秒后过滤，滤液应是无色透明即可应用，贮存于冰箱内。（染液变红既不能应用）2苏木精贮存液：苏木精1g，纯酒精200ml，明矾钾或铵20g，加水200ml，氯化红汞0.5g3苏木精应用液：贮存液50ml，冰醋酸2ml，可以连用，但要注意经常添加冰醋酸0.5ml42高碘酸：高碘酸1.0g，蒸馏水 50ml。595酒精三、方法：1干燥血片或骨髓片入95酒精固定10分钟（95酒精用滴管滴于片子上），后，用滤纸吸干，勿用水洗。2入2高碘酸15分钟（用滴管滴于片子上），水洗，晒干。3入雪夫式试剂1小时，流水冲5分钟（入雪夫式试剂后放371小时）4入苏木精20分钟，流水冲2分钟，待干油镜观察。四、结果判断正常血细胞的染色反应1、 粒细胞系统 原始粒细胞为阴性反应，自早幼粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应，并随细胞的成熟，阳性反应的程度逐渐增强，嗜酸性粒细胞的颗粒本身不着色，而颗粒之间的胞浆呈红色，嗜碱性粒细胞为阳性反应，阳性反应物质为大小不一的紫红色颗粒。2、 红细胞系统 正常幼红细胞和红细胞均呈阴性反应。3、 单核细胞系统 原始单核细胞为阴性反应，幼单核细胞为（+）阳性反应，单核细胞为（+）（+）阳性反应，有时在胞质的边缘处阳性反应颗粒较粗大。4、 淋巴细胞 大多数淋巴细胞为阴性反应，少数淋巴细胞可呈（+）阳性反应。5、 巨核细胞和血小板 巨核细胞为阳性反应，阳性反应物质为红色颗粒状，有时为红色块状。血小板为阳性反应，阳性反应物质为细颗粒状，有时为红色小块状。6、 其他细胞 浆细胞一般为阴性反应，少数可呈阳性反应，阳性反应物质为细颗粒状。巨噬细胞可呈阳性反应，阳性反应物质为红色细颗粒状。判定结果时需要根据可疑疾病来判断。例如：怀疑患者为红白血病，则计数100个幼红细胞，计算阳性率。怀疑患者为巨核细胞白血病，则计数100个巨核细胞，计算阳性率。MDS（可阳性）、巨幼贫（阴性）、缺铁贫（可阳性）、溶贫（阴性）均计数幼红细胞。急淋、慢淋、淋巴肉瘤、何杰金氏病计数淋巴细胞。五、临床意义： 1鉴别淋巴系统增生的性质。凡恶性增生时PAS多呈强阳性，阳性反应见于急性慢性淋巴细胞白血病淋巴瘤等。急性淋巴细胞性白血病的原幼细胞常为大块状阳性，也有阴性者。慢性淋巴细胞性白血病的淋巴细胞呈阳性反应，淋巴肉瘤及何奇金病的恶变淋巴细胞呈强阳性。传染性单核细胞增多症和传染性淋巴细胞增多症的淋巴细胞一般呈阴性反应。2. 巨核细胞呈强阳性反应，有助于巨核细胞白血病的诊断。3. 鉴别红系增生的性质。凡恶性增生者，如红血病，其原幼红细胞多呈强阳性反应，而增生性贫血和巨幼细胞性贫血时PAS多为阴性。红血病、红白血病的幼红细胞呈强阳性反应，骨髓增生异常综合征的幼红细胞可呈阳性反应。溶血性贫血、巨幼细胞性贫血的幼红细胞一般呈阴性反应。4. 高血细胞与尼曼匹克细胞的鉴别，前者强阳性，后者为阴性或弱阳性。5. 急性单核细胞性白血病的原幼细胞呈细小颗粒状阳性。急性粒细胞性白血病的原幼细胞大多为弥漫状弱阳性或阴性。六、注意事项：1. 雪夫试剂应避光保存，呈无色方可使用。2. 阴性反应时并不能除外急性淋巴细胞性白血病，应结合其它检查与急粒或急单白血病鉴别。 酯酶双染一、-丁酸萘酚酯酶染色（一）原理：血细胞内的-丁酸萘酚酯酶（alpha-naphthol butyrate esterase, -NBE）在碱性条件下，将基质液中的-丁酸萘酚水解，释放-萘酚，再与偶氮付品红形成不溶性暗红沉淀，定位于胞浆内。（二）试剂：1. 固定液：甲醛-丙酮-缓冲液（ph6.6，同ANAE）配方：Na2HPO4100mg(或Na2HPO4.12H2O 250mg即0.25g)+ KH2PO4 500mg+蒸馏水150ml+丙酮225ml+36%甲醛(36ml甲醛加蒸馏水至100ml)125ml,溶解后，混匀，过滤。2.基质液：A.磷酸盐缓冲液：47.5ml（1/15KH2PO4 77ml+1/15 Na2HPO4 23ml） 1/15KH2PO4的配制：KH2PO4分子量136.09，配500ml即0.5升所需KH2PO4的量（g）为136.090.51/15g 也就是4.536 g KH2PO4加500ml蒸馏水即为1/15KH2PO4 1/15 Na2HPO4的配制：11.938 gNa2HPO4.12H2O（分子量为358.14加500ml蒸馏水即为1/15 Na2HPO41/15 Na2HPO4 B. -酊酸萘酯0.05ml溶于2.5ml乙二醇独甲醚 C. 0.25ml付品红和亚硝酸钠合液（4付品红0.125ml+4亚硝酸钠0.125ml）充分混匀，气泡保留1分钟。注意：4付品红配制：付品红1g放入25ml2M HCL轻微加热促溶，勿煮沸，放凉过滤。4亚硝酸钠配制：0.2g亚硝酸钠+5ml蒸馏水 将B液加入A液中，混匀，再将C液加入A、B混和液中，充分混匀，过滤备用。 3. NaF 75mg抑制试验(三)、染色步骤：1.新鲜涂片在甲醛-丙酮-缓冲液中固定30秒（410），蒸馏水冲洗，晾干。2.片子1（不做抑制实验的）入基质液I中，30分钟（37），蒸馏水冲洗，晾干。3基质液I中加入NaF 75mg，片子2（做抑制实验的）放入，30分钟（37），蒸馏水冲洗，晾干。4片子1、2同时做氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色5. 片子1、2入苏木精复染30分钟，蒸馏水冲洗，晾干镜检。 (四)、结果判断： 单核细胞为弥漫性暗红色正常血细胞的染色反应1、 粒细胞系统 原粒细胞为阴性反应或阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均为阳性反应，酶活性并不随细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，嗜碱性粒细胞为阳性反应。2、 其他血细胞 单核细胞为阴性反应，个别可呈阳性反应。淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞和血小板均呈阴性反应。判定结果时，计数100个原始细胞（原粒原幼单），计算呈兰色颗粒细胞、呈棕色反应细胞、阴性细胞百分比。（五）、临床意义： 1.急性粒细胞白血病时，白血病原粒细胞为阴性反应；急性单核细胞白血病时，白血病原始单核细胞、幼单核细胞和单核细胞可呈阳性反应；急性粒-单核细胞白血病时，部分白血病细胞呈阳性反应，部分白血病细胞呈阴性反应。 2.急性单核细胞白血病有时须与组织细胞白血病鉴别。异常组织细胞也可呈阳性反应，但酶反应不被NaF抑制，而白血病单核细胞的阳性反应可被NaF抑制。二、氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色（一）、原理：血细胞内的氯醋酸AS-D萘酚酯酶（naphthol AS-D chloroacetate esterase,AS-D NCE），将基质液中的氯醋酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，再与固兰 BB偶联，形成蓝色颗粒，均定位于胞浆中。（二）、试剂：1. 基质液：A、0.025M，ph7.4巴比妥-盐酸缓冲液47.5ml（0.025M Hcl 41.9ml+0.025 M巴比妥钠58.1ml配成0.025M，ph7.4巴比妥-盐酸缓冲液）0. 025M Hcl配制：2.08 ml浓盐酸加蒸馏水至1000 ml即为0.025M Hcl0.025 M巴比妥钠配制：5.15g巴比妥钠加蒸馏水至1000ml B、氯醋酸AS-D萘酚：5mg溶于1ml丙酮中 C、固兰BB 25mg 将C溶于A液中，再将B液溶于A、C混和液中，过滤备用。 （三）、染色步骤： 1. 新鲜涂片在甲醛-丙酮-缓冲液中固定30秒（410），蒸馏水冲洗，晾干。2. 入基质液II中，30分钟（37），蒸馏水冲洗，晾干。3. 苏木精复染30分钟，蒸馏水冲洗，晾干镜检。 (四) 、结果判断：粒细胞为兰色颗粒正常血细胞的染色反应3、 粒细胞系统 原粒细胞为阴性反应或阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均为阳性反应，酶活性并不随细胞的成熟而增强。嗜酸性粒细胞为阴性反应或弱阳性反应，嗜碱性粒细胞为阳性反应。4、 其他血细胞 单核细胞为阴性反应，个别可呈阳性反应。淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞和血小板均呈阴性反应。判定结果时，计数100个原始细胞（原粒原幼单），计算呈兰色颗粒细胞、呈棕色反应细胞、阴性细胞百分比。(五) 、临床意义 帮助鉴别急性白血病的类型。急性粒细胞白血病时，白血病性原始粒细胞可出现阳性反应；急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病时，白细胞细胞均呈阴性反应；急性粒-单核下边白血病时，部分白血病细胞呈阳性反应（原粒和早幼粒），有些白血病细胞呈阴性反应（原始单核和幼单核性别）。酸性磷酸酶（ACP）及酸性磷酸酶抑制试验（ACP-T）一、原理： 血细胞内的酸性磷酸酶在酸性条件下，将基质中的磷酸萘酚AS-BI水解，释出萘酚AS-BI，萘酚AS-BI与六偶氮付品红偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。如果血细胞的胞质呈红色为阳性反应，无红色为阴性反应。二、基质液的配制：1、Naphthol AS-BI phosphate（磷酸萘酚AS-BI）20mg溶于NN二甲基甲酰胺1 ml2、0.2M醋酸盐缓冲液 PH5.2：0.2M HAC （0.2M HAC 配制：5.9 ml HAC加蒸馏水至500 ml即为0.2M HAC） 21ml + 0.2M NaAC 79ml （ 0.2M NaAC配制：8.201g NaAC加蒸馏水至500 ml） 3、Fast Red ITR Salt (快红) 30mg 将快红溶于缓冲液中，再加入已溶好的磷酸萘酚，过滤于两个染色缸内，其中一个染色缸加L-酒石酸75 mg或左旋酒石酸代替做抑制试验。三、方法：1、BM 或BL用福尔马林熏蒸固定5分钟，流水冲洗。2、入基质液37，2-2.5小时，流水冲洗后，待干。3、苏木精染色30-60分钟