分子生物学重要试题及答案.doc

1、 试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法（1）、基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。其基本原理是根据理论上任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特意序列，因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10各碱基的核苷酸序列并制成标签连接、克隆测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。（2）、RNA选择性剪切机制RNA的选择性剪切是指用不同的剪切方式(选择不同的剪切位点组合)从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪切异构体的过程。一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5选择性剪切、3选择性剪切，外显子遗漏，相互排斥性剪切。可以RT-PCR的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。其步骤是：首先以cRNA两端特异性引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异。如果发现差异，测序后可以分析出这种差异是否来自于选择性剪切。选择性剪切使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。（3）、原位杂交技术原位杂交(in situ hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类：1、RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。（4）定点突变技术定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。但目前为止选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性。主要是采用两种PCR方法来实现：重叠延伸技术和大引物诱变法在基因序列中进行定点突变。（5）RNAi技术RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。其过程一般为：在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)，然后又siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体，再又RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。同时，siRNA可作为特殊引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。(6)一些基本分子生物学手段在启动子上游构建增强子、细菌培养时加入诱导物诱导产物生成等。2、论述原核生物和真核生物基因组的异同1原核生物的基因组结构特点1.1染色体数量少，一般只有一条染色体,即一个核苷酸分子,无细胞核1.2DNA结构特点。大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在，核苷酸大多数为环状,少数为线状有些细菌有染色体外遗传因子,即质粒DNA。1.3基因组小，结构简单，DNA一般只有单一复制起点，基因组中含有数百个至数千个基因，基因组内核苷酸大多数序列用于编码多肽以及tRNA,rRNA等,仅少量的非编码核苷酸序列构成调控元件，基因的编码序列通常是连续的,中间无非编码成分。1.4转录单元。原核生物基因组中,功能相关的基因常丛集在基因组的一个或几个特定部位,形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控,它们可被转录为多个mRNA分子,叫多顺反子，操纵子是最具典型的模式。1.5重叠基因，一些细菌同一段DNA能携带不同的蛋白质信息，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。2 真核生物的基因组结构特点2.1染色体数量多,结构复杂由几个或几十个更多的双链DNA分子组成。存在以核小体为单位的染色质结构,这是原核生物基因不具有的，核小体是绕在4对组蛋白H2A,H2B, H3, H4所组成的八聚体核心外两周,并含有连接区的一个分子的H1组蛋白,整个DNA分子与蛋白质稳定地结合。2.2DNA结构特点，都是双链双螺旋结构,核苷酸分子多数为线状，含有原核生物不同的染色体外遗传因子,如有细胞器基因,线粒体DNA等。2.3基因组大，结构复杂，DNA有多个复制起点，每个基因组中含有数万个基因。2.4重复序列，大致分为:单拷贝序列基因组中只有一个拷贝,占基因组的40%70%；少量重复序列每一种序列的重复次数大约210拷贝组成串联重复基因；中度重复序列这些序列一般是分散的,每一种序列的重复次数大约十个到数百个拷贝；高度重复序列这些序列一般是不分散的,大部分集中在异染色体中,特别是在中心粒和端粒的附近。比如卫星DNA。2.5基因家族。真核基因都是单顺反子，即一个结构基因转录一个mRNA分子、翻译一条多肽链，许多功能相关的基因成套组合,形成基因家族。2.6断裂基因。真核生物无操纵子,基因是不连续的,同一基因的编码序列被数量不等的非编码间隔隔成多个较小的片段,编码蛋白的片段叫外显子(exon),非编码蛋白的片段叫内含子(intron)，内含子虽然不被翻译,但特定的核苷酸序列对RNA的精确剪接加工是不可缺少的。3、 论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同总体来说，真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。如何实施调控,二者差距明显。真核生物,激素水平和发育阶段是基因表达调控的主要手段,而营养条件和环境因素的影响力大为下降。真核基因表达以正性调控为主导，基因的转录与染色质的结构变化相关,真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内),需对内含子精确剪接加工，翻译则多在胞浆,两个过程是分开的。基因表达调控的环节比原核生物更多。原核生物中,营养条件和环境因素对基因表达调控起举足轻重的作用，mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起,如细菌。所以细菌的转录和翻译几乎发生在同一时间间隔内,转录和翻译相耦联。详细分析其特点如下：原核生物的基因表达调控特点1.转录水平的调控无论原核生物还是真核生物的基因调控主要是转录水平的,原核生物不同于真核生物的基因结构,存在转录单元,即操纵子，原核生物的转录受操纵子控制。1.1RNA聚合酶与启动子的影响DNA转录RNA合成起始时,只有带有因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，因子能提高酶辨认启动子的能力，若启动子与聚合酶结合紧密,则基因获得较高水平的转录,否则,转录水平较低，另外,还发现有些基因有增强子，位于转录起始的上游,是强化转录起始的序列。1.2代谢产物的调控可诱导调节：在代谢产物或化合物的诱导下,使基因活化,操纵子由关闭状态转为工作状态，如大肠杆菌的乳糖操纵子：无诱导物存在时，阻遏物与操作基因结合使得结构基因不能正常转录；诱导物（乳糖或IPTG）存在，与阻遏物结合时，阻遏物从操纵基因上脱离下来，RNA聚合酶便可通过启动子和操作基因正常转录出一条多顺反子mRNA从而翻译得到三种酶。可阻遏调节：基因转录平时是开启的,但由于某些特殊代谢产物或化合物的积累将其关闭,阻遏基因的转录,不能合成蛋白质或酶。如大肠杆菌的色氨酸操纵子：trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白的基因是trpR，它结合于trp 操纵基因特异序列,阻止转录起始。当Trp 水平低时,阻遏蛋白以一种非活性形式存在,不能结合DNA。这时 Trp 生物合成途径被激活；trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。在大肠杆菌trp operon,前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,能以两种不同的方式进行碱基配对, 1 - 2和3 -4配对,或2 - 3配对, 3 - 4配对区正好位于终止密码子的识别区。前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,当培养基中Trp 浓度很低时,负载有Trp 的tR2NATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2 - 3配对,不形成3 - 4配对的终止结构,所以转录可继续进行。反之,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2 - 3不能配对, 3 - 4 区可以配对形成终止子结构, 转录停止。1.3降解物对基因转录的调节细菌在有葡萄糖存在的培养基情况下,即使加入乳糖、半乳糖等诱导物,与其相应的操纵子也不会启动，这是由于葡萄糖抑制了细菌的腺苷酸环化酶,减少环腺苷酸(cAMP)的合成。当培养基中的葡萄糖减少时,则环腺苷酸的活力提高, cAMP的合成增加, cAMP与CRP形成复合物并与操纵子结合,促进乳糖的表达。降解物的抑制作用是通过促进基因转录来正常调节基因表达的。1.4细菌的应急反应对基因表达的调控细菌在生存条件危急时,如氨基酸全面匮乏,细菌会产生一个应急反应:包括生产各种RNA、糖、脂肪、蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，因为此时细菌细胞中存在大量不载氨基酸的tRNA,空载的tRNA激活焦磷酸转移酶,使鸟苷四磷酸(ppGpp)大量合成, ppGpp的出现会关闭许多基因除ppGpp外,实施应急反应的额信号还有鸟苷五磷酸(pppGpp)它们的作用十分广泛,影响一大批操纵子,是基因转录的超级调控因子。1.5亮氨酸的影响亮氨酸通过亮氨酸反应蛋白Lrp对基因表达的激活或阻遏起调节作用，某些亮氨酸影响基因表达的操纵子，外加丙氨酸也有类似效果。2原核生物基因的转录后调控2.1 翻译起始的调控遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。所谓RBS是指起始密码子AUG上有的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，富含G、A，该序列与核糖体16SrRNA的3端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。此外，mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素。2.2稀有密码子的影响由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。比如dnaG基因就是一个很好的例子。2.3重叠基因的影响色氨酸操纵子由五个基因(trpE、D、C、B、A)组成，在正常的情况下,这五个基因产物是等量的。比较研究发现当trpE发生突变后,其临近的trpD的产量比下游的trpB、A要低，这是因为trpE基因的终止密码子和trpD的起始密码子之间共用了一个含碱基A核苷酸是重叠的，这种重叠的密码是保证同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制而在trpC和trpB之间相隔11个核苷酸,因而没有这种机制。这种偶联翻译机制可能是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。2.4 ploy(A)对翻译的影响mRNA 3端ploy(A)的长短对翻译效率也有很大影响。细胞中蛋白质合成旺盛时，mRNA链上的核糖体数量就多，mRNA链上的ploy(A)也较长。2.5 翻译的阻遏序列分析表明，有些位点能形成稳定的茎-环结构，具备翻译阻遏特征。2.6魔斑核苷酸对翻译的影响研究发现在缺少任何一种氨基酸的培养基中,不但蛋白质合成速率下降,而且RNA的合成也下降。后来又发现大肠杆菌突变株在色氨酸不足时,蛋白质合成停止,而RNA合成却没有下降。进一步研究发现前者能合成魔斑(ppGpp和pppGpp)，由于氨基酸缺乏,空载tRNA增多,空载tRNA在核糖体上将正常合成蛋白质需要的GTP合成魔斑，PpGpp可以大范围内作出应急反应,以控制核糖体和其它大分子的合成,活化蛋白水解酶。2.7MicRNA对翻译的影响真核生物基因表达的调控的特点1DNA染色质结构的调控真核生物存在DNA和染色质的调控作用,原核生物无此特点，即以核小体为单位的核蛋白结构，只有当紧密压缩的异染色质转变为松疏、伸展形式的常染色质,在基因控制区改变结构,产生DNase超敏感区,使基因激活,才能促进转录，组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录,去除组蛋基因又能够转录，DNA碱基修饰变化,甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。2转录调控2.1顺式作用元件的调控真核生物无操纵子以及与操纵基因相临的调节基因,但其转录受到与结构基因相距一定距离的特定顺式作用元件的影响如:增强子、启动子、位点控制区。真核生物的启动子,在-25-35区含有TATA序列,在-70-80区含有CCAAT序列,在-80-110区含有GCCACACCC前者精确地保证转录起始;后两者控制转录起始的频率,不参与起始位点的确定，真核基因启动子区较大,转录成mRNA具有“帽子”结构，真核基因的增强子能使与它连锁的基因的转录频率明显增加，增强效应不受它在DNA上位置的影响,也不具有基因的专一性;但有严格的组织和细胞特异性,受外部信号的调控。2.2反式作用因子的调控真核基因转录还需相应的反式作用因子作用,是通过顺式作用元件与反式作用因子复杂的相互作用实现的，反式作用因子主要是一些调控蛋白,不具有基因的特异性，另外,还有一些转录因子能与某个(类)蛋白质因子结合,控制基因特异性表达的上游序列,如:热激活应答元件HSE,糖皮质应答元件GRE,金属应答元件MRE等,这些应答元件与细胞内高度专一的转录因子相互作用,协调基因的相关转录。真核生物的DNA能根据发育阶段的需要,以基因丢失、拷贝数扩增、基因重排与移位等方式的进行发育调控,这种调控是可逆的,可从根本上改变某些细胞的基因组。2.3激素水平的调控真核生物基因表达的激素调节相当于原核生物对环境变化所作出的反应。激素由细胞产生,再运送到靶细胞内实施调控。许多激素的调节作用是启始转录，激素调节具有很强的组织特异性。3RNA对基因表达的调控tRNA,rRNA,mRNA为蛋白质翻译所必需，真核生物的前体tRNA先要经过核苷酸的修饰,生成4、5sRNA,再剪接为成熟的4sRNA、前体rRNA须经过核糖甲基化才能成熟;而原核生物的rRNA主要是碱基化。真核生物转录产生的mRNA,需进行一系列的加工,才能生成成熟的mRNA，包括mRNA5端加“帽子”, 3端加poly (A),以及内含子的精确剪接加工,原核生物却无此特点。此外, mRNA还会进行核苷酸的替换、插入、删除等编辑修饰,改变DNA模板的遗传信息。4翻译调控4.1翻译起始的调控真核生物具有“帽子”结构,翻译效率受到“帽子”的制约，“帽子”结合蛋白CBP具有促进mRNA翻译蛋白的活性，但在高盐溶度下,有“帽子”的mRNA的翻译能力严重受阻。许多可溶性蛋白因子的修饰会影响翻译起始。4.2翻译延伸的调控翻译起始后,核糖体并非一定能从起始密码顺序移至终止密码,mRNA编码区也会形成一些二级结构,使翻译速率下降,甚至中途停止。另外,3端的poly(A)的长短、以及与rRNA的互补性也影响翻译水平。4.3蛋白质的加工成熟翻译初生的原始蛋白质大多无生物活性,必须经过一系列加工才能成为有活性的蛋白质。这些加工包括切割多肽、多肽的有限水解、多肽的化学修饰(如:鳞酸化,糖基化)、多肽的剪接。4、举出三种基因文库的构建中对重组质粒的筛选方法并解释其原理重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括：根据遗传表型筛选（包括抗生素平板筛选和互补筛选等）、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、免疫学筛查法、菌落PCR筛选法、DNA-蛋白质相互作用筛选法、DNA序列分析等。1、 抗生素平板筛选其原理是：目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp的抗性基因，因此在含有Amp和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。大概步骤包括：首先制备含有Amp和Kan的LB琼脂培养板； 然后将转化菌液涂布于含有Amp和Kan培养板上，37培养；最后在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒，并将其接种于含Kan的LB液体培养基继续培养。小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。2、 互补筛选（蓝白斑筛选）适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫互补。由互补而产生的Lac+细菌在呈色底物X-gal和诱导剂IPTG存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。3、 菌落PCR该方法是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳等手段来鉴定筛选阳性转化子，最后可以经提取质粒DNA进行酶切和质粒PCR双重鉴定以及测序分析进一步确认菌落PCR的结果。实验中细菌经过94变性以后，大部分细胞破裂，释放出其DNA，因此可将其细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA。由于这种方法直接以菌落为模板,不需要进行任何特殊处理,并可以快速、特异、有效地对大批重组克隆筛选进行筛选，适合于各种载体，应用广泛。4、 杂交探针技术在基因文库的构建中，制备好合适的文库后，如果用可获得目的基因的互补DNA或RNA做探针，就可以利用核酸杂交技术鉴定出特定的重组体克隆。其原理是：任两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。杂交探针技术的基本步骤：首先把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，处理除去杂质，只留下DNA。通常以上处理步骤同时会使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键会断裂。然后短时间的80C的加热会使这些单链DNA分子牢固结合到膜上。DNA分子与膜结合其碱基是自由的，可以自由配对。然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。经过一段时间，等杂交已经发生后，洗去没有结合的探针，干燥，现在就可以检测结合的探针的位置了，从而筛选出想要获得阳性克隆。另外给探针标记的方法，传统的是标记具有放射性的核苷酸，其杂交信号的位置可以通过放射自显影探测出来。不过，上述方法已经不再流行，部分是因为对人身体有伤害，部分是因为实验产生的放射性污染物问题。因此现在有两种比较流行的方法，一种是使用dUTP和生物素反应，再用反应产物去标记探针，是探针带上生物素，结果可通过荧光标记的抗生物素蛋白去检出探针的位置。另一种方法是将探针DNA分子用辣根过氧化物酶标记，可发出化学荧光信号，这种信号可以被普通胶卷记录下来。实际上，我们可以通过已有的有关基因的信息来确定探针的性质。可以考虑一下3个可能性：（1）目标基因在某种细胞类型中高表达，可以考虑从这种特定细胞类型的文库中筛选出该基因。（2）该基因编码的蛋白质的氨基酸序列已知或部分已知。（3）该基因属于某个已知家族5、 基于鉴定克隆基因产物的鉴定技术免疫学筛查法要从一个基因文库中鉴定某一特定的重组体，通常会优先考虑杂交探针技术。但我们必须首先获得与目标基因在序列上至少互补的探针，这就限制了它的应用。那么在这种情况下，我们可以使用杂交探针技术最主要的替代方法免疫学筛查法。他们的区别在于，前者检测的是克隆基因本身，而后者检测的是克隆基因编码的蛋白。免疫学筛查法的原理是抗体和抗原的特异性结合。最常用的免疫学筛查法是直接配对检出。把重组体克隆转移到聚乙烯膜上，用氯仿裂解细胞，再加上包含特定抗体的溶液。为了便于检出，可直接标记抗体，也可以在抗体抗原结合后，用标记的蛋白A（proteinA）溶液洗膜，蛋白A是一种细菌蛋白，可特异地与免疫球蛋白（抗体的主要成分）相结合。标记可以选择放射性元素，这样将通过放射自显影技术被检测；或者也可以使用荧光或化学发光信号做标记。5、对天然质粒的人工构建、改造通常需要对质粒哪些方面进行操作、改进对于天然质粒应该做以下几方面的操作、改进：1. 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段2. 削减载体的分子量，是载体具有更大的容纳外源片段的能力3. 加上易于选择或检测的标记，以便筛选出阳性克隆4. 限制性内切酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体的特定位置5. 加上一些调控元件，有利于基因的表达6. 安全性改造（因为是简答题，以下四点可以不要，但建议最好要）（1） 非传递性和不被带动转移。在基因工程操作中，不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移（2） 具有条件致死突变。如温度敏感时就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中（3） 一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后可能给宿主带来突变（4） 有较小的宿主范围6. 2008年诺贝尔生理或医学奖三名欧洲科学家因为发现两种引发人类致命疾病的病毒而荣获2008年诺贝尔生理学或医学奖。 德国人哈拉尔德楚尔豪森在上世纪70年代开始的研究中发现导致宫颈癌的HPV(人乳头状瘤病毒)，为宫颈癌疫苗今天的诞生奠定了基础。法国人弗朗索瓦丝巴尔-西诺西和吕克蒙塔尼在上世纪80年代发现了艾滋病病毒，使医学界找到了确诊艾滋病病毒感染的办法，延缓了这种病毒的传播。人乳头状瘤病毒HPV(人乳头状瘤病毒)的发现，使得宫颈癌成为迄今病因最明确的一种癌症。在此基础上，葛兰素史克等制药公司开发出宫颈癌疫苗，使宫颈癌成为人类可以预防和根除的第一种恶性肿瘤。豪森教授在研究中证实了宫颈癌和HPV之间存在联系，并使得医学界最终认识到，几乎所有的宫颈癌都是由HPV引起，其中，大部分的病例可以归咎于两种亚型的HPV，即HPV-16和HPV-18。豪森还发现，除了上述两种亚型之外，其他一些亚型的HPV病毒也可能导致宫颈癌。此后一些研究证实，还有十多种亚型的HPV病毒可以导致宫颈癌，其中包括导致宫颈癌的第三大病毒亚型HPV-45和第四大病毒亚型HPV-31。豪森的成果使得医学界对于宫颈癌的发病机理有了深入了解，为此后制药公司开发宫颈癌疫苗奠定了基础。其中，葛兰素史克公司开发的“Cervarix”疫苗可以有效抵抗引起宫颈癌的前四大病毒亚型：HPV-16、HPV-18、HPV-45和HPV-31，保护期超过6年。宫颈癌是女性最常见的癌症之一，约80%有性行为的女性在一生中随时可能感染HPV病毒。全世界每年有49.3万名女性确诊患有宫颈癌，其中27.3万人死亡，多数是在发展中国家。疫苗的问世使得女性终于可以远离这种恶性肿瘤。医学界发现，女性在有性行为前接种宫颈癌疫苗最为有效。艾滋病病毒1981年，美国一些年轻的同性恋者先后因一种奇怪的疾病死去。美国疾病控制和预防中心意识到问题的严重性，迅速成立了一个专门小组，并将这种奇怪疾病命名为“获得性免疫缺陷综合征”，即人们常说的艾滋病。1982年，该中心一项大范围的调查得出结论：艾滋病正在全球迅速蔓延，患者主要为同性恋和静脉注射毒品者，特征是血液中CD4T淋巴细胞下降至几近于零。那么，艾滋病病原体到底是什么呢？1983年，在法国巴黎的实验室中，两名科学家弗朗索瓦丝巴尔-西诺西和吕克蒙塔尼开始从淋巴结肿大的同性恋艾滋病早期患者身上提取淋巴细胞。他们认为，艾滋病患者血液内CD4T淋巴细胞数量迅速减少表明它们可能是艾滋病病毒攻击的目标，定期分析艾滋病早期患者的淋巴细胞有助于找到艾滋病病毒。这是一个后来给他们带来无数荣誉的决定，他们很快就发现了人类免疫缺陷病毒(HIV)，也就是如今人们熟知的艾滋病病毒。1983年5月，他们的论文发表在美国著名学术期刊科学上。瑞典卡罗林斯卡医学院6日在新闻公报中说，发现艾滋病病毒是“从生物学上了解艾滋病和其反逆转录病毒疗法的首要条件”，两名法国人的工作“导致了艾滋病诊断和血液产品筛选方法的出现，艾滋病预防与治疗的结合有效减缓了艾滋病的流行，并大幅提高了艾滋病患者的平均寿命”。不过，目前仍没有有效的艾滋病疗法和疫苗。值得一提的是，巴尔-西诺西与蒙塔尼得到了美国科学家罗伯特加洛的帮助，才真正确认HIV就是他们要寻找的艾滋病病毒。后来，双方一度为到底谁是艾滋病病毒的发现者争论不休，这一争论曾引起法国和美国两个国家之间的法律甚至外交纠纷。不过，诺贝尔奖评审委员会说，在科学界，对蒙塔尼和巴尔-西诺西首先发现艾滋病病毒这一点没有争议。双方的争论实际上集中在这之后的诸如诊断工具开发等事务上，但这都以发现病毒为基础。2008年诺贝尔化学奖揭晓北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y. Tsien（钱永健，钱学森的堂侄）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。人们之前对该奖项的预测成为现实。今年的诺贝尔化学奖奖励的是对GFP的原初发现以及一系列的重要发展，这些发展已经作为标记工具在生物科学中使用。通过DNA技术，研究人员现在能够将GFP和其他有趣但却不可见的蛋白联系起来。发光标记使科学家能够观察蛋白的运动、位置以及相互作用绿色荧光蛋白于1962年首次在Aequorea victoria（一种随北美西海岸洋流漂移的水母）中被观察到。从那时开始，它就成为当代生物科学最重要的工具之一。在GFP的帮助下，研究人员已经发展出多种方法来观察先前不可见的过程，比如大脑神经细胞的发育和癌细胞如何进行扩散。 数万种不同的蛋白存在于活有机体内，控制着重要化学过程的微小细节。如果这一蛋白机器出现故障，疾病就会随之而来。这就是为什么生物科学如此急切地要描绘出身体中不同蛋白的功能。在GFP的帮助下，研究人员也可以跟踪研究多种不同细胞的命运，比如阿尔海默氏症中神经细胞的损伤，或者一个正在发育的胚胎的胰腺，如何创造出产胰岛素的细胞。在一项独特的研究中，科学家用各种颜色成功标记了小鼠大脑中的不同神经细胞。 获奖三位科学家分别的贡献如下： 下村修首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要贡献在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。下村修，1928年生于日本京都，1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位，美国Woods Hole海洋生物学实验室（MBL）和波士顿大学医学院名誉退休教授。Martin Chalfie，1947年出生，成长于美国芝加哥，1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位，1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授。钱永健，1952年出生于美国纽约，1977年获得英国剑桥大学生理学博士学位，1989年起任美国加州大学圣地亚哥分校教授。 据悉，三人将平分1000万瑞典克朗的奖金。 8. 真核生物蛋白质的翻译后加工有哪些？ 1）N端fMet或Met的切除2）二硫键的形成：由两个半胱氨酸氧化而成3）特定氨基酸的修饰：磷酸化，核糖化，甲基化，乙基化，羟基化，羧基化4）切除新生肽链中非功能片段9. 酶的分离纯化主要过程及注意事项是什么？ 酶的分离提纯包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。 根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:(1)要注意防止酶的变性失活.(2)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供 直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。10. 大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构和阻遏蛋白的作用机制是什么？ 1）大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因。基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。2）阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子半乳糖苷酶、透酶生成。 当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数 -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。 3）CAP的正性调节 分解代谢物基因激活蛋白 CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。 由此可见，对乳糖操纵子来说 CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。 4）对调节机制的解释 大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。 倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与 O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源11. 请列举出5种真核生物中存在的RNA 并概括它们的功能。 转运RNA：转运氨基酸；核糖体RNA：核蛋白体组成；信使RNA：蛋白质合成模板；核不均一RNA:成熟mRNA的前提；小核RNA:参与和不均一RNA的剪接；小胞浆RNA：蛋白质内质网定位合成的信号识别体成分的组成；反义RNA：对基因的表达起调节作用12克隆一个基因后，如何鉴定其功能。1）根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。载体含有lacZ的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。2）核酸杂交法利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。3）PCR法PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。4）免疫学方利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。5）DNA限制性内切酶图谱分析这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用Eoor I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。6）核苷酸序列测定所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在实验教材中有详细的叙述。13. 简述原核生物转录起始与转录终止过程中涉及到的主要蛋白质和核酸结构及其具体作用 1) RNA聚合酶：催化RNA的生物合成2）四种碱基：合成RNA的原料3）因子：提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力。14. 试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？）染色体方面：原核生物为环状DNA分子，且DNA裸露或结合少量蛋白质，只有一个基因连锁群；真核生物为线性双链DNA分子，且DNA同组蛋白和非组蛋白结合，有2个以上基因连锁群。）染色体遗传物质：原核生物为质粒，真核生物为细胞器基因组。）转录单元：原核生物为多顺反子，真核生物为单顺反子，基因家族。）DNA序列：原核生物无或很少有重复序列，真核生物有重复序列。）基因表达：原核生物RNA和蛋白质在同一区间合成，有重叠基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白质在细胞中合成，有断裂基因ssss 15. 什么是操纵子（operon)?试说明色氨酸操纵子（Trp operon)在原核基因表达调控中的调控机制和重要作用。.操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。单顺反子：在真核生物中，一个编码基因多转录成一个mRNA分子，经翻译只生成一条多肽链，这样的一个转录单位称为单顺反子，真核生物中的基因都是以单顺反子的形式存在。 色氨酸操纵子结构是一种负控阻遏系统，它含有5种结构基因：TrpE, D, C, B, A （2）它的调控结构：启动子， 操纵子，前导序列，弱化子。（3）阻遏物Trp基因：它与Trp操纵子相距较远。大量Trp存在时，大肠杆菌的5种酶的转录同时受到抑制，Trp不足时 ，这5 酶基因开始转录。前导序列中含有衰减子区域，在前导序列中第10位和第11位有相邻两个色氨酸密码子，参与转录弱化机制。弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置：（1） 当Trp浓度高时，可完整翻译成短肽，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录前，核糖体就到达2区，这样使2-3区不能配对，3-4区可自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止。Trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。（2） 当Trp浓度低时，负载有Trp的转运RNA也少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才到达1区，这时的前导区结构是2-3区配对，不形成3-4区配对的终止结构，故转录可继续进行，直到将Trp操纵子的结构基因全部转录。16. 阐述酵母转录激活因子GAL4的调控方式及其在酵母双杂合系统(yeast two hybrid system)中的应用基本原理 1）真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。 2）若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基3） 主要实验过程：a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。17、病毒、原核、真核基因组的特点？答：1、病毒基因组的特点：种类单一；单倍体基因组：每个基因组在病毒中只出现一次；形式多样；大小不一；基因重叠；动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。2、原核基因组的特点：为一条环状双链DNA；只有一个复制起点；具有操纵子结构；绝大部分为单拷贝；可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；基因一般是连续的，无内含子；重复序列很少。3、真核基因组的特点：真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；基因组中非编码区多于编码区；真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的基因构成各种基因家族；存在可移动的遗传因素；体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。18、乳糖操纵子的作用机制？答：1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合