【医学ppt课件】细胞因子.ppt

1细胞因子的定义和分类2细胞因子的共同特征和生物学功能 Cytokineandcytokinereceptors ChapterIII Historyfortheresearchofthecytokines In1974 denominatedcytokine cytokinology internationalcytokinesociety Cytokine Companiesfordevelopingcytokinesinmanycountries In1957 Interferon IFN wasfound In1969 termedlymphokine macrophage ActivatedTh1cell a A D P56BC58 B C NH2 COOH IL 2 Cytockinesarelow molecular weightregulatoryproteinsorglycoproteinssecretedbywhitebloodcellsandvariouscells vascularendothelialcell epidermiccellandfibroblast inbodyinresponsetoanumberofstimuli Cytokine Cytokinegene Inducingstimulus Cytokine producingcell Cytokine Geneactivation Receptor signal Biologicaleffects OverviewoftheinductionandfunctionofCytokine Signaltransducersandactivatoroftranscription IBiologicaleffects Biologicaleffectsofthecytokines Anti infectionandantitumorImmuneregulationapoptosisStimulatingtheproliferationanddifferentiationofhemopoieticstemcellsPromotethegrowthanddifferentiationofvariouscellsParticipationandregulationoftheinflammatoryresponsesCytokineabnormalitiesinthepathogenesisincertaindiseases Justashormonesserveasmessengeroftheendocrinesystem socytokineseverasmessengersoftheimmunesystem Unlikeendocrinehormones though whichexerttheireffectsoverlargedistances cytokinesgeneralactlocally 1 interleukin IL 白细胞介素 2 colonystimulatingfactor CSF 集落刺激因子 3 interferon IFN 干扰素 4 tumornecrosisfactor TNF 肿瘤坏死因子 5 Chemokine CK 趋化因子 6 growthfactor GF 生长因子 IIcytokines IL 13 IL 2 IL 4 1Interleukin ILInterleukinsaresecretedbysomeleukocytesandactuponotherleukocytes IL 1 IL 23havebeenidentified 2Colonystimulatingfactor CSFThecytokinesthatstimulatehemopoieticcellstoformcellcolony ParticipatehemopoieticfunctionarecalledCSF forexampleGM CSF G CSF M CSF Epo Tpo G CSF GM CSF ThefunctionsofCSF Thecytokinesthatresistviralinfection andinterfereviralreplication includingIFN IFN typeI IFN typeII 3Interferon IFN virus cell infection IFN IFN IFN IFN Theanti virusmechanismofIFN a virus viralreplication Inhibitionofviralreplication Signal transduction IFN a IFN inducedprotein stimulating nuclear nuclear 4Tumornecrosisfactor TNF Thecytokinesthatinducedirectlyapoptosisoftumorcells includingTNF TNF Lymphotoxin T FASL CD70L CD30L CD40L OX40L TRAIL TNFrelatedapoptosis inducingligand TNF a Thecytokinesthatpromotegrowthofvariouscells epidermalgrowthfactor insulin likegrowthfactor vascularendothelialgrowthfactor 5Growthfactor vascularendothelialgrowthfactor VEGF VEGFpromotesTumorAngiogenesis VEGFpromotesTumorAngiogenesis 6Chemokine chemokines agroupoflow molecular weightcytokinwsincludinginterleuki8 thataffectchemotaxisandotheraspectsofleukocytebehavior StromalDerivedFactor 1a SolutionStructureOfTheCx3CChemokineDomainOfFractalkine Cytokinespossessingchemotaxis C5a cytokine IL 8 Chemokinemaketheshapesofcellschanged IIIProductionofcytokines 1NormalcellsActivatedlymphocyte activatedmonocyte macrophage NKcell fibroblast epithelialcell endothelialcell 2TumorcellsJurkatcell WEHI 3 myelomacell3GeneticengineeringtechniqueEngineeringcells suchasE coli yeastproducetherecombinantcytokines E coli Cytokinegene E coliexpressesthecytokineprotein purification Cytokine product IVPropertiesofCytokines autocrine endocrine Bindingtotargetcellsindistantpartsofthebody paracrine Bindingtoreceptorsonatargetcellincloseproximitytotheproducercells 1 Actionmanners Bindtoreceptorsonthemembraneofthesamecellthatsecretedit Mastcell Thymuscell B IL 4 Activationproliferationdifferentiation proliferation proliferation 2 Pleiotropy IL 2 IL 4 IL 5 IL 4 IL 5 IL 4 IFN 5 Antagonism 3 Redundancy 4 synergy StimulatingtheproliferationoftheBcells MoreeffectivelyinducingtheexchangeofIgE IL 4interdictstheactionthatIFN inducesIgexchanges B B B Onstimulation rapidsynthesis release actionanddegradation 6 Rapidity 7 highpotency Infinitesimalcytokinesperformremarkablebiologicaleffects pM 10 12M Performinthenon specificmanner andnotrestrictedbyMHC 8 Non specificity 9 bindingtospecificreceptorsandperformance S S S S S S CCCC C1C3C2 C1C3C2 C1C3C2 C1C3C2 G蛋白 免疫球蛋白超家族受体 I类细胞因子受体 II类细胞因子受体 TNF R 趋化因子受体 IL 1M CSFC kit IL 2IL 3IL 4IL 5IL 6IL 7 IL 9IL 11IL 12IL 13IL 15OSM GM CSFG CSFLIFCNTF生长激素催乳素 IFN aIFN bIFN g TNF aTNF bCD40神经生长因子 NGF FAS IL 8RANTESMIP 1PF4MCAFNAP 2 细胞因子受体分类 细胞因子受体 免疫球蛋白超家族 IgsF 造血细胞因子受体超家族 HCKRsF 趋化因子受体超家族 ChRsF TFN受体超家族 TNFRsF IFN受体家族 Solublecytokinereceptors sCKR Producingmatter Mostofthembreakofffromthememberreceptors Secretereceptor memberreceptors Secretereceptor VCytokineandclinicalapplication relateddiseases deficiencyofcytokinesandreceptorsoverexpressionofcytokineshighleverofsolublecytokinereceptorsTherapeuticuseofcytokinesandtheirreceptors supplyandadditionblockageandantagonist 1Commondiseases InfectiousdiseasestumorPlantationrejectionhematocytopeniahypersensitivityAutoimmunediseases X linkedSCID XSCID Deficiencyofcytokinesandreceptors Mutationsinthe c common chain chainofthereceptorsforinterleukinsIL 2 4 7 9and 15 Signaltransduction lymphocytedifferentiation proliferationandmaturation IL 2RIL 4RIL 7RIL 9RIL 15R common chain 细胞因子引起的病理反应 大剂量TNF 注射造成恶液质的小鼠模型 2细胞因子与临床治疗 1 细胞因子抑制剂的临床应用 IL 1受体拮抗剂 IL 1ra 治疗类风湿关节炎 细胞因子抑制剂用于治疗炎症 自身免疫病 移植排斥 休克 进入临床实验的细胞因子抑制剂 名称 公司 适应症 临床阶段 可溶性IL 1受体 干粉吸入剂 Immunex 哮喘 I II期 可溶性IL 1受体 注射剂 急性髓样白血病 I期 IL 1受体拮抗剂 Amegen 败血性休克 试验中止 类风湿关节炎 完成III期 可溶性IL 4受体 Immunex 哮喘 I II期 抗IL 4人源化抗体 SmithKline 哮喘 I II期 抗IL 5人源化抗体 SmithKline 哮喘 II期 可溶性TNF受体II Fc融合蛋白 Immunex 类风湿关节炎 慢性心衰 上市 I期 可溶性TNF受体I Fc融合蛋白 Hoffmann LaRoch 休克 类风湿关节炎 多发性硬化症 II III期 抗TNF 单抗 infliximab Centocor Crohn sDisease 上市 人源化抗HER2 EGFR2 单抗 Genentech 乳腺癌转移 上市 DAB389 IL 2 IL 2免疫毒素 Seragen T细胞淋巴瘤 I型糖尿病 严重类风湿关节炎 牛皮癣 HIV感染 上市I II期 2 细胞因子的临床应用 已批准上市的细胞因子基因工程药物 正进行临床试验的细胞因子基因工程药物 细胞因子名称 适应症 公司 IL 10 炎症 银屑病 Crohn s病 类风湿关节炎 Immunex Schering Plough IL 12 肿瘤 HIV感染 I型变态反应 GI Tpo 血小板减少症 GI 沈阳三生 TNF 变异体 肿瘤 国内多家企业 Flt3 flk3Ligand FL 肿瘤 Immunex MyeloidProgenitorInhibitoryFactor 1 MPIF 1 肿瘤大剂量化疗 HGS TGF 慢性皮肤溃疡 多发性硬化症 Genzyme KeratinocyteGrowthFactor 2 KGF 2 促进烧伤 慢性溃疡的伤口愈合 抗癌药物引起的粘膜损伤 炎症性肠道疾病 HGS MIP 1 变异体 肿瘤化疗的骨髓保护作用 BritishBiotech OPG osteoprotegerin 骨质疏松 Amgen Mulitkine 白细胞产生的细胞因子混合制剂 转移性肿瘤 CEL SCI B细胞刺激因子 BlyS 免疫缺陷 HGS 二 细胞因子的研究热点1 新细胞因子的基因克隆化2 细胞因子受体的基因克隆化3 细胞因子信号转导机制4 新一代细胞因子 高活性 多功能 低毒副作用 长半衰期 高稳定性5 细胞因子作为生物应答调节剂 BRM 的临床应用6 细胞因子表达调控7 细胞因子基因治疗 1 新细胞因子的基因克隆化 从人类基因组发现新细胞因子 后基因组时代的 捞鱼 1 传统的细胞因子克隆化策略活性筛选发现免疫分子的活性线索 免疫分子表达细胞 提取mRNA 逆转录成为cDNA 克隆化至真核表达载体 转化大肠杆菌 免疫分子活性筛选 鉴定 2 可溶性细胞因子受体作为拮抗剂 effects N C 5 3 DNA Protein 1 细胞因子受体的克隆 5 3 DNA PCR 可溶性细胞因子受体 express Receptorblocker asareceptorantagonist 2 细胞因子受体的突变 3 细胞因子和受体相互关系的研究 利用酵母双杂交系统研究蛋白与蛋白相互关系 酵母 A B C 酵母双杂交系统的建立基于 真核生物调控转录起始 酵母双杂交系统的建立与发展 酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成 含有881个氨基酸 它有两个结构域 1 DNA结合结构域 DNAbindingdomain DB 由位于N 末端1 147个氨基酸构成 能识别位于Gal4基因的上游激活序列 UAS upstreamactivatingsequence 此外 在其N 端还具有一段核定位序列 2 转录激活结构域 activationdomain AD 由位于C 末端的768 881位氨基酸构成 当Gal4的两个结构域位于不同肽链上 只要它们在空间上充分接近 则能够恢复Gal4作为转录因子的活性 NormalTranscription NormaltranscriptionrequiresboththeDNA bindingdomain BD andtheactivationdomain AD ofatranscriptionalactivator TA DB AD Reportergene areportergene whichissimplyagenewhoseproteinproductcanbeeasilydetectedandmeasured X Y Ga14的DB Ga14的AD 诱饵 bait 猎物 prey 报道基因 表达 报道基因的基因产物 通过对报道基因表达产物的检测 反过来可判别作为 诱饵 和 猎物 的两个蛋白之间是否可存在相互作用 Plasmidconstruction The bait and hunter fusionproteinsareconstructedinthesamemanner The bait DNAisisolatedandinsertedintoaplasmidadjacenttotheGAL4DBDNA WhenthisDNAistranscribed the bait proteinwillnowcontaintheGAL4DNA bindingdomainaswell The prey fusionproteincontainstheGAL4AD Theyeasttwo hybridassayusestwoplasmidconstructs thebaitplasmid whichistheproteinofinterestfusedtoaGAL4bindingdomain andthehunterplasmid whichisthepotentialbindingpartnerfusedtoaGAL4activationdomain Ga14蛋白调控的GAL1序列 半乳糖苷酶的LacZ Field改造LacZ基因 将其整合到酵母菌染色体URA3位上 URA3 URA3 酵母菌的GaL4基因和GaL80基因 Gal80是Gal4的负调控基因 被缺失 报道基因 表达融合蛋白的载体 URA3 转化酵母菌 URA3 表达 半乳糖苷酶 已知 Ga14的DB 融合蛋白 GENE DB X Y 猎物 诱饵 由X和Y相互作用使得AD和BD在空间上接近 激活了报告基因LacZ的转录 一般地 将DB X的融合蛋白称作诱饵 bait X往往是已知蛋白 AD Y称作猎物 prey 整个实验过程称作 狩猎 hunt或fish K Ga14的DB 融合蛋白 表达融合蛋白的载体 URA3 转化酵母菌 URA3 同时转化了细胞因子 已知 和细胞因子的受体 未知 融合表达载体的酵母细胞才有 半乳糖苷酶的活性 单独转化其中任何一个载体都不能检测出 半乳糖苷酶的活性 表达 半乳糖苷酶 三杂交系统 两个蛋白之间通过第三者发生相互作用 第三者可以是蛋白质 小分子或RNA 通过小分子 配体 相互作用的三杂交系统 小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础 而且在医学领域有重要的价值 Licitra等利用FK506与地塞米松杂合分子 将与LexA BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵 用于筛选与AD融合的JurkatcDNA文库 分离了与FK506结合的蛋白FKBP12 猎物 DB 诱饵 GENE LexA Glucoroticoid Glucoroticoidreceptor FK506 FKBP 利用FK506与地塞米松杂合分子 将与LexA BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵 用于筛选与AD融合的JurkatcDNA文库 分离了与FK506结合的蛋白FKBP12 利用三杂交系统进行药物的筛选 一用已知的药物靶点筛选小分子化合物 DB GENE LexA 小分子化合物 RMP1 RMP1 二用已知的小分子化合物筛选药物靶点 DB GENE LexA 小分子化合物 RMP1 药物作用的受体 用于筛选与AD融合的药物受体的cDNA文库 分离与已知小分子化合物结合的蛋白 药物作用的靶点 4 新一代细胞因子 高活性 多功能 低毒副作用 长半衰期 高稳定性 Engineeringproteinstoaltertheirproperties G CSF 17 CCC C C S S SH C C S S S S C C S S G CSF 17C A 17 ACC Mutation dimers 1可溶性细胞因子检测 ELISA 2细胞膜上细胞因子或受体的研究 免疫组化 3免疫印迹法 Westernblotting 细胞因子或受体 抗原 人 特异性单克隆抗体 一抗 酶标的兔 羊 抗人抗体 二抗 免疫学检测法 检测细胞因子蛋白质的抗原特性 四甲基联苯胺 1 组织切片 细胞涂片 抗原 一抗 特异性抗体 洗涤 辣根过氧化物酶标记的二抗 2免疫组化 immunohistochemistry 洗涤 辣根过氧化物酶的底物 邻苯二胺 底物转化为产物 显微镜下观察 直肠腺癌MDR 原位杂交图直肠腺癌MDR免疫组化图 胃低分化腺癌LMW角蛋白免疫组化图 乳腺癌p53免疫荧光图 3免疫印迹法 Westernblotting M stain MarkerSample SDS PAGE 硝酸纤维膜 聚丙烯酰胺凝胶电泳 硝酸纤维膜 一抗 特异性抗体 洗涤 辣根过氧化物酶标记的二抗 底物 Westernblot PAGE X2 M M stain No stain 1 3h Transferassemble brillo pads Whatman 1filter paper PAGEgel nitrocellulose positiveelectrode negative electrode stain Immersedinasolutionoftheantibody washing Immersedinasolutionofthesecondantibody washing IgG HRP M M Theclone expressionandactivitytestofHumanIL 8DNA http www ncbi nih gov IL 8以二聚体形式存在 IL 8分子的第1个 片层有一个疏水性区域 2个IK 8分子单体即通过各自 片层的疏水性作用形成二聚体 NH2 NH2 HOOC COOH 41 340 人IL 8DNA序列和氨基酸序列 实验课用 DEFINITIONHomosapiens interleukin8 clone mRNA completecds1605bpSOURCEHomosapiensCDS41 340人IL 8DNA序列和氨