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NO试剂盒说明书一氧化碳试剂盒说明书(硝酸还原酶法)一.测定意义：NO化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐(NO3)和亚硝酸盐(NO2),血清(NO3)与(NO2)浓度之和(NO2+NO3)才能准确代表体内(NO)水平。血清(NO3+NO2)含量测定，国内有的单位采用金属镉还原法，但该法操作繁琐(血清需除蛋白)，反应不易控制(金属镉可将NO2进一步还原)，且不能完全将NO3还原为NO2，准确性差。本测试法为一种灵敏、简捷、快速、稳定、易推广的方法。二、原理：NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2和NO3，而NO2又进一步转化为N03-,而NO2-又进一步转化为NO3-,本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。一、试剂组成与配制：1.试剂一：液体6ml2瓶(50T)如6ml1瓶(25T)，-20以下保存。使用前请放37水浴中或室温使其溶解后再用。2.试剂二：液体6ml2瓶(50T)如6ml1瓶(25T)，-20以下保存。使用前请放37水浴中或室温后再用。混合试剂的配制：按试剂一：试剂二=1：1的比例配制，用多少配多少，配好后充分混合后待用，现用现配3、试剂三：液体12ml1瓶(50T)如6ml1瓶(25T)，室温保存4、试剂四：液体6ml1瓶(50T)如3ml1瓶(25T),室温保存5、试剂五：粉剂1支，用时加90-100热蒸馏水20ml(50T)如10ml(25T)注，充分溶解，避光保存。6、试剂六：粉剂1支，用时加蒸馏水8ml(50T)如4ml(25T),避光冷藏保存，当颜色变成深咖啡色不可再用。7、试剂七：液体8ml50T(4ml25T)1瓶，室温保存。显色剂的配制：需多少配多少试剂五：试剂六：试剂七=2.5：1：1.若能在一月内用完者也可以一次配成。剩余显色剂置于乘蒸馏水的40ml方瓶中，避光保存天冷会有结晶析出，再次使用时，放在100水浴，反复摇动溶解后使用。8、10nmol/L标准品0.5ml1支，-20以下保存。100umol/L标准应用液的配制：取0.1ml标准品用蒸馏水定溶稀释至10ml(即100倍稀释)，混匀，即为100umol/L标准应用液。另附，试剂五、试剂六及标准品的蒸馏水40ml2(50T)如40ml1(25T)瓶。【注】试剂五为过饱和溶液，所以在配制时最好用90-100的热蒸馏水23ml(50T)如13ml(25T)(热张冷缩)边隔水加热边用玻璃棒搅拌以使其充分溶解。一次实验用不完再用时可能仍有结晶，用之前可以再次边隔水加水边玻璃棒搅拌使其溶解(隔水加热：取干净的小烧杯倒入试剂五，在加入90-100的热蒸馏水23ml(50T)如13ml(25T)，在将此小烧杯中的试剂搅拌溶解，试剂五溶液一次实验用不完再用时可能仍有结晶，用之前把盛有试剂五溶液的小烧杯房在另一有热水的盆或锅或烧杯中，注意千万别把小烧杯中的试剂弄翻。这时用玻璃棒将小烧杯中的试剂搅拌溶解。)二、操作步骤：(一)血清，胃液、尿液、细胞培养液等标本1.操作空白管标准管测定管蒸馏水ml0.1 100umol/L标准应用液ml0.1样本ml0.1混合试剂ml 0.40.40.4混匀，37准确水浴60分钟试剂三ml 0.20.20.2试剂四ml 0.10.10.1充分旋涡混匀30秒，室温静置40分钟，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清显色。上清ml 0.50.50.5显色剂ml 0.60.60.6混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，测各管吸光度值注意点：1、冬天测试时，所有试剂均应置于37预热5分钟。2、取上清时，如果上清量不够，请延长离心时间或者少取点。例如：可取0.4或0.45ml，但您同一批实验所有的管子都应取上清的量要一致，千万不可将沉淀吸上。计算公式：NO含量(umol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准品浓度(100umol/L)样品测试前稀释倍数(二)组织样本检测1、操作2、空白管标准管测定管蒸馏水ml 0.50.4 100umol/L标准应用液ml0.1样本ml0.5混合试剂ml 0.40.40.4混匀，37准确水浴60分钟试剂三ml 0.20.20.2试剂四ml 0.10.10.1充分旋涡混匀30秒，室温静置40分钟，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清显色。上清ml 0.80.80.8显色剂ml 0.60.60.6混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，测各管吸光度值注意点：1、冬天测试时，所有试剂均应置于37预热5分钟。2、取上清时，如果上清量不够，请延长离心时间或者少取点。例如：可取0.4或0.45ml，但您同一批实验所有的管子都应取上清的量要一致，千万不可将沉淀吸上。计算公式：NO含量(umol/gprot)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准品浓度(20umol/L)样本的蛋白含量(gprot/L)注：umol/gprot为微摩尔/克蛋白六最佳参考取样量：1、牛和羊血清取300ul，兔和鼠取100ul；2、10%组织匀浆一般取500ul；3、细胞悬液一般取500ul，细胞培养液一般取100ul。正常参考值样本参考取样量参考值大鼠血清100ul 38.023.4umol/L小鼠血清100ul 49.9623.76umol/L兔血清100ul 99.1639.5umol/L狗血清100ul 89.5132.13umol/L注意点：1.因组织中NO含量较少，组织匀浆一般为10%或20%，且做好的组织匀浆离心速度2000转/分，离心10分钟，转速不可过高，时间不可太长，样本取样量较大，以0.3-0.5ml左右为宜2.试剂一、试剂二和标准避免反复冻融，如果需要分批实验(三次以上)，可以在第一次实验时将试剂一，试剂二和标准分装后再保存，根据每次实验时的试剂用量取出待用配好的显色剂避光保存。3.血清(浆)、组织等标本如不马上检测，应放在-70以下保存，半年内有效。4.所有配试剂的蒸馏水和空白管中加入的蒸馏水均要不含NO2的双蒸水或三蒸水(试剂盒中配有双蒸水)。5.在样本与底物反应完毕后，离心，取上清时千万不可将沉淀