TDZ对蓝莓茎段和叶片离体培养的影响.docx

天津农学院毕 业 论 文 中文题目:TDZ对蓝莓茎段和叶片离体培养的影响 英文题目:Effects of TDZ on Blueberry Stem Section andLeaf Culture in Vitro 学生姓名 杨坤 二级学院 园艺园林学院 系 别 园艺系 专业班级 2013 级园艺专业蔬菜班 指导教师 柴慈江 成绩评定 2017年6月目 录1 前言12 材料与方法22.1 试验材料22.2 试验方法23 结果与分析33.1 不同TDZ浓度对同一蓝莓品种下茎段的影响33.2不同TDZ浓度对同一蓝莓品种下叶片离体的影响43.3 TDZ浓度和品种处理组合对蓝莓试管苗茎段培养的影响53.4不同品种下相同TDZ浓度对蓝莓茎段的影响83.5 不同品种下相同TDZ浓度对蓝莓叶片离体的影响93.6 品种与TDZ浓度处理组合对蓝莓叶片离体培养的影响94 讨论114.1 不同TDZ浓度对不同品种蓝莓茎段的影响 114.2 不同TDZ浓度对不同品种蓝莓离体叶片的影响114.3 不同蓝莓品种对TDZ培养效果的差异性125 结论13参考文献14致谢15附录1 相关英文文献16附录2 英文文献中文译文21摘 要此项研究有关TDZ对于蓝莓茎段和叶片离体培养的影响。在附加6-BA0.5mg/L和0.1mg/L的IBA的WPM培养基中，分别加入0、0.003、0.006、0.012、0.018mg/L的TDZ，接种蓝莓试管苗茎段或叶片进行培养。结果表明当TDZ浓度为0.003 mg/L时北陆蓝莓茎段培养结果的各项指标达到最佳，繁殖系数为16.5；当TDZ浓度为0.012mg/L时，蓝丰和北陆蓝莓叶片离体培养结果的各项指标达到最佳，且叶片的芽分化率为53.3%，每叶片平均分化1.37个芽。TDZ可促进北陆茎段培养中繁殖系数的提高，但对斯巴坦和瑞卡的茎段培养有抑制作用。在含有不同浓度TDZ的培养基中，北陆、蓝丰和爱国者3个蓝莓品种的叶片离体培养效果没有表现出明显的差异。关键词: 蓝莓；试管苗；TDZ；茎段培养；叶片培养ABSTRACTThe aim of this study was to investigate the effects of TDZ on the in vitro culture of stem segments and leaves of blueberry. With 0, 0.003, 0.006, 0.012, 0.018mg/L TDZ added in WPM medium with 6-BA0.5mg/L and 0.1mg/L IBA, the stem section culture or leaf culture of blueberry were carried out. The results showed that when TDZ was 0.003mg/L the propagation coefficient of the blueberry stem sections was 16.5 which was the best. With the TDZ concentration of 0.012mg/L the leaf culture had the best effect, with bud differentiate rate of 53.3% and bud number of 1.37 per leaf.TDZ could increase the propagation coefficient of the “north land blueberry stem sections but could decline the propagation coefficient of the “Sbutan” and “Ruika” blueberry stem sections. In media with different concentration of TDZ the leaf culture effects had no significant difference among “Patriot ”, “Blue crop” and “north land” blueberry cultivars.Keywords: Blueberry; plantlet in vitro;TDZ;stem section culture; leaf cultureTDZ对蓝莓茎段和叶片离体培养的影响杨坤（天津农学院 园艺园林学院）1 前言蓝莓又名越桔、蓝浆果，为多年生落叶的灌木且果实多为浆果类。蓝莓富含多种保健功效并且多含维生素等，具有较高的经济价值和广阔的开发前景1。在蓝莓育苗方面用常规扦插法相比速度就比较慢，并且在繁殖方面还受到扦插条数的限制的同时短期内还不能满足生产需求，而且常规扦插方法繁育的苗木在生长势、果实品质等方面与组培苗相比有很多不足之处2-3。所以就目前技术来讲进行蓝莓优质苗木的组织培养快速繁殖技术是最为优选的4。蓝莓组织培养快速繁殖的关键是丛生芽的诱导、增殖与生根，以及组培苗的炼苗与移栽5。近几年国内对蓝莓快速繁殖组织培养的技术的研究已经比较成熟并且已经在生产中得到应用。茎芽增殖是植物组织培养快速繁殖技术的关键环节之一，而对于蓝莓试管苗的茎芽增殖有许多研究。龚雪元等利用两种优良成熟蓝莓的茎段腋芽为外植体，研究了基本培养基、植物生长调节剂对诱导蓝莓丛生芽增殖的影响，剪除丛生芽对诱导新一代丛生芽增殖的影响，同时进行了试管微芽的继代增殖培养。其结果表明，南高丛蓝莓丛生芽最佳诱导培养基为WPM+ZT2.5 mg/L，试管微芽继代增殖最适培养基为WPM+ZT0.3mg/L；兔眼蓝莓丛生芽最佳诱导培养基是WPM-A+ZT2.5 mg/L，试管微芽继代增殖最佳培养基是WPM+ZT 2.0mg/L，从而得出结论，在诱导新一代丛生芽时对老的丛生芽进行剪除有着显著的促进作用6。沙玉芬等在研究蓝莓茎段组织快繁技术方面，以北高丛蓝莓品种杜克为试材，春季一年生新梢茎段为材料进行组织快繁，结果表明最佳增殖培养基改良WPM+ZT 1.0 mg/L，增殖系数为12.8，生长健壮，平均株高4.8 cm 7。廉家盛等以蓝莓“美登”品种为外植体作为相关试材料，结果表明以B5培养基中加入2.0 mg/L的ZT，pH值在5.4时不定芽分化数量最多，其中玉米素最佳浓度为2.0 mg/L，附加2%蔗糖的WPM培养基上外植体芽的诱导率最高，生长最旺盛，效果较理想8。李杰等研究也认为，蓝莓外植体芽诱导培养基中ZT的浓度以2.0mg/L最好9。目前蓝莓组织培养快速繁殖中的茎芽增殖培养基普遍使用ZT促进芽的萌发，但是ZT价格比较昂贵，寻找ZT的廉价替代品对降低蓝莓试管苗的成本具有一定实际意义。叶片培养是培育转基因植物的基础性工作。蓝莓的叶片培养目前已有一些报道。孙阳等在蓝莓品种叶片离体再生及生根技术研究方面，以Sierra、Bluecrop和Toro蓝莓品种试管苗为试材，以改良WMP为基本培养基，研究不同浓度的玉米素和生长素对3个蓝莓品种叶片离体再生分化率及生根速度的影响。结果表明不同品种对于叶片离体再生的能力不同，以Toro叶片再生能力最强，Bluecrop最差，玉米素浓度在0.15 mg/L时对蓝莓叶片离体再生效果最佳，而生长素对于蓝莓叶片的再生离体再生影响较小。不同品种之间的叶片生根速率差异也十分显著，当玉米素浓度为0.15 mg/L，生长素浓度为0.01 mg/L时，三个品种叶片离体再生效果最佳，从而优选出诱导分化率较高的蓝莓品种Toro和Siena10。崔光荣等同样以高灌蓝莓试管苗叶片作为外植体，以改良WPM为基本培养基，研究外源激素TDZ,ZT及其组合对离体叶片胚状体发生的影响。结果表明不同浓度的TDZ，ZT以及组合对胚状体的发生频率、丛芽的形成和生长起重要作用，适合高灌蓝莓叶片胚状体发生及成苗的培养基为WPM+TDZ0.04 mg/L+ZT0.25-2.0 mg/L+蔗糖20-40 g/L，而培养基WPM+ZT0.5-1.0 mg/L+蔗糖20g/L适合于丛芽继代生长11。TDZ是一种人工合成的苯基脲衍生物，已被广泛应用于植物组织培养形态发生的高效生物调节剂。它能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能12。TDZ在组培中应用广泛，植物中许多生理生化现象受TDZ影响。近年来研究初步表明，TDZ是通过调节内源激素起作用，或是诱导胁迫的结果13。在有关运用TDZ作为植物生理激素调节剂的实验和研究也普遍存在的。例如TDZ对甜椒的不定芽分化的影响，以甜椒的子叶、真叶、下胚轴为外植体，采用了不同浓度的TDZ与IAA、6-BA的配比，对甜椒不定芽分化的研究，结果表明在诱导过程中添加TDZ能够很好得提高分化效率14。利用TDZ能否替代ZT进行蓝莓试管苗茎芽增殖的培养，目前未见研究报道，蓝莓叶片培养中虽然有一些研究中使用了TDZ，但TDZ的效果不尽一致。因此，本项研究的目的在于探讨TDZ对于蓝莓茎段茎芽增殖培养的效果，以及TDZ与6-BA及生长素搭配后对蓝莓叶片离体培养的影响，为降低蓝莓试管苗的培养成本及完善蓝莓叶片培养技术提供依据。2 试验材料与方法2.1试验材料在含有1.0mg/LZT的WPM培养基中进行蓝莓试管苗的继代培养，当试管苗茎生长至30cm以上时，取试管苗茎段或叶片用作本项研究的试材。2.2试验内容与方法2.1.1不同TDZ浓度影响蓝莓试管苗茎段培养效果的研究该试验为TDZ浓度和蓝莓品种两因素试验，TDZ浓度设计为0 mg/L、0.003 mg/L 、0.006 mg/L 、0.012 mg/L、0.018 mg/L5个水平，蓝莓品种设计为北陆（B）、斯巴坦（S）和瑞卡（R）3个水平。在含有6-BA0.5mg/L和IBA0.1mg/L的WPM培养基中分别加入上述各种浓度的TDZ，培养基用7.5g/L的琼脂做固化剂，pH值调至5.3，用50ml三角瓶做培养容器，每瓶加入的培养基含量约为25mL，培养基用棉塞封口后，在121、0.11-0.12Mp条件下灭菌20min。灭菌后每瓶接种5个长约1cm的蓝莓试管苗茎段，每个处理接种两瓶共10个茎段，即每个处理重复10次。接种后将培养瓶放置于恒温培养室培养，培养室温度为22-28，光照1500lx，每天光照14h。培养60天后调查每个茎段形成的茎尖数、新生茎长和繁殖系数，按照完全随机试验两向分组资料的分析方法进行方差分析。2.2.2不同TDZ浓度影响蓝莓叶片离体培养效果的研究该试验同样为TDZ浓度与蓝莓品种两因素试验，TDZ的设计水平及培养基成分、配制灭菌方法等均同于试验2.2.1，蓝莓品种因素的水平设计为北陆（B）、蓝丰（L）和爱国者（A）3个品种。培养基灭菌后，将3个蓝莓品种的试管苗叶片接种于含有不同浓度TDZ的培养基中，每个处理接种2瓶，每瓶10片叶片，每处理共接种20片离体叶片。培养40天后调查叶片的愈伤组织发生率、叶片上芽的分化率和叶片上分化的芽数。愈伤组织发生率和芽分化率用卡方测验进行差异显著性测验，分化芽数则用两向分组资料的方法进行方差分析。2 结果与分析3.1 不同TDZ浓度对蓝莓试管苗茎段培养的影响不同TDZ浓度对同一品种下蓝莓茎段的试验结果见表1。由表1可见，不同TDZ浓度处理的蓝莓茎段的试管苗在茎尖数各处理间观察不存在显著性差异，在最大茎长与繁殖系数之间存在着一定的处理间的显著性差异。这表明不同TDZ浓度对蓝莓茎段三个指标是存在一定影响的。从茎尖数来看，随着TDZ浓度的逐级增加，茎尖数反而呈现一个递减的趋势，在空白对照组0mg/L时反而达到最大值1.07，但是各处理间又不存在一个很明显的差异，所以这一结果反映出在控制蓝莓品种条件下对于不同浓度的TDZ对蓝莓茎段试管苗茎尖数的影响是不大的，但是在今后的类似试验中如果增加TDZ的浓度含量后是否继续存在这一现象还有待研究。从最大茎长来看，随着TDZ浓度的增加，最大茎长逐渐减少，也呈现出一个递减的趋势，在空白对照组0mg/L时达到最大值的37.8mm。在0-0.003这个浓度区间时，发现这两个处理间是不存在显著性差异的，而随之浓度增加到0.006mg/L以后，与前面两个浓度处理就发生了显著性差异，并且随着浓度继续增加到0.018mg/L时，在0.006-0.018mg/L这个处理区间内不存在显著性差异。从茎段的繁殖系数来看，在0-0.003mg/L的浓度范围内，随着TDZ浓度的增加，繁殖系数呈现明显高于其他处理组合的趋势，且在0.003mg/L达到了最大值的8.4，且极显著地高于其他处理组合。但随着TDZ浓度的逐渐增加，繁殖系数逐渐降低呈缓慢下降趋势，在0.006-0.018mg/L的范围内繁殖系数并没有显著变化，且这三个处理间没有显著差异。表1 不同TDZ浓度同一品种下蓝莓茎段培养的效果TDZ浓度（mg.L-1）茎尖数（个）最大茎长（mm）繁殖系数01.07a37.8a7.4ab0.0030.83 a36.7a8.4 a0.0060.73 a21.5ab4.3 ab0.0120.67 a12.9b3.0 b0.0180.63 a11.9 b2.3b综上所述，添加TDZ可以促进蓝莓茎段试管苗的茎段萌芽和新生芽的伸长和生长，进而增加繁殖系数。同时在本试验采用的浓度范围内，添加0.003mg/L的TDZ时试管苗茎段不仅萌芽较多、新生芽较长，而且繁殖系数在各处理中相对比较也是最大的，为本次试验的最佳浓度处理。并且在一般情况下认为繁殖系数达到3以上才符合快速繁殖的一个指标，在0.003mg/L的浓度下能高达8.4上述结果表明，添加TDZ对蓝莓试管苗茎段培养中的茎芽增殖没有促进作用，较高浓度的TDZ反而对此有抑制作用。3.2 不同品种的蓝莓在TDZ条件下的茎段培养效果不同品种在TDZ条件下对蓝莓茎段培养的试验结果见表2。由表2可见，在控制了TDZ浓度的变化从不同品种的条件下来试验，各处理组合间存在着显著性差异，在茎尖数、最大茎长和繁殖系数三个指标中都有所体现。从茎尖数来看，B品种的茎尖数在三个品种中为最大的1.94，与其它两个处理的茎尖数相比较存在显著性差异，但差数也不是很大。其中R品种的茎尖数结果来看，应该是对TDZ的效果影响是最小的，S品种与R品种之间从茎尖数观察不存在着显著性差异。表2 不同品种在TDZ条件下对蓝莓试管苗茎段培养的影响蓝莓品种茎尖数（个）最大茎长（mm）繁殖系数北陆（B）1.94a42.5a9.22a斯巴坦（S）1.64b7.94b1.26c瑞卡（R）1.22b22.0b4.78b从最大茎长来看，B品种的最大茎长为3个品种中的最大值为42.5mm，显著高于其它两个品种；S品种与R品种之间虽然没有存在显著性差异，但是S品种的最大茎长只有7.94且为三个品种之中的最小值。这表明在控制TDZ浓度变化的条件下来观察品种间的差异性时，对于S品种的影响相对于其它两个品种来说是比较小的。从茎段的繁殖系数来看，B品种的繁殖系数达到最大值的9.22且显著高于其它两个品种，达到并超过快速繁殖的基本值，而S品种在繁殖系数方面对于TDZ的影响就没有那么大了，且繁殖系数最小。R品种的繁殖系数也达到并超过了快速繁殖的一个基本值为4.78，三个品种之间在繁殖系数上都存在着各处理间的显著性差异，这一结果也对今后在研究和试验快速繁殖在品种间的差异提供了一个基础。由此可见，在TDZ对不同蓝莓品种的茎段影响中，B品种各项处理指标都达到最大值，应该可以达到快速繁殖的技术要求。而针对S品种的各项处理指标中，相比B、R两个均势品种来讲就没有太大的促进作用，但是在后期的观察和试验中，如果加大对S品种使用的TDZ浓度或减小对其它品种的TDZ浓度，从而观察其茎尖数、最大茎长和繁殖系数是否能达到快速繁殖的目的和要求还有待研究和进一步的试验。3.3 TDZ浓度和品种处理组合对蓝莓试管苗茎段培养的影响TDZ浓度和品种处理组合对蓝莓试管苗茎段培养的影响的试验结果见表3。通过表3我们可以看出在分别讨论了浓度和品种对蓝莓试管苗茎段培养的影响后，进行了处理组合，从不同浓度和不同品种的复因素条件下来观察三个指标分别有着不同的显著性差异。表3 TDZ浓度和品种处理组合对蓝莓试管苗茎段培养的影响蓝莓品种TDZ含量（mg/L）茎尖数（个）最大茎长（mm）繁殖系数北陆（B）00.1e15.0 cd1.6cd北陆（B）0.0033.0 a67.2 ab16.5a北陆（B）0.0062.8 a61.1 ab12.5ab北陆（B）0.0122.0 abc38.8 bc8.9 bc北陆（B）0.0181.8 abcd30.7 cd6.6 bcd瑞卡（R）02.3 ab78.0 a16.8a瑞卡（R）0.0031.2 bcd27.0 cd6.6bcd瑞卡（R）0.0060 e0 d0 d瑞卡（R）0.0120 e0 d0 d瑞卡（R）0.0180. 1e5 d0.5d斯巴坦（S）00.8 cde20.4 cd3.7cd斯巴坦（S）0.0030.4 de16 cd2.1cd斯巴坦（S）0.0060.3 e3.3 d0.5d斯巴坦（S）0.0120 e0 d0d斯巴坦（S）0.0180 e0 d0d从B品种先观察，随着TDZ浓度的逐渐增加，从0到0.018mg/L这个区间内，茎尖数是逐渐减少，除去空白对照，在0.003mg/L时为一个最大值的3.0，并且在0.003和0.006mg/L这两个处理间是不存在显著性差异的，而在随后的浓度变化范围内，两处理相对于剩下两个浓度区间存在着显著性差异，而0.012和0.018mg/L这两个处理间又是不存在显著性差异的且差额不是很大。从最大茎长观察，随之浓度的增加类似于茎尖数也在逐渐减少，在0.003mg/L时同样达到一个最大值为67.2mm，并且在0.003和0.006mg/L这两个处理间没有显著性差异，而在随后的0.012到0.018mg/L这两个浓度区间时，两两之间存在着显著性差异，个体之间却不存在着显著性差异，且差额不是很大。最后从繁殖系数来看，同样是随着浓度的增加使得繁殖系数呈现一个递减的趋势，同样在0.003mg/L这个浓度时达到最大值为16.5，达到并且超过了快速繁殖的一个基本值。并且在随后的各浓度处理之间各自都存在着显著性差异，并且在0.006到0.012mg/L这个浓度递增时存在了极显著性差异。综上所述在B品种各项指标的数据分析下来看，当TDZ浓度为0.003mg/L各项指标都均达到一个峰值，且显著高于其他处理组合。从R品种来看，在TDZ浓度的变化总体范围内观察，各项指标茎尖数、最大茎长以及繁殖系数中，空白对照组反而成为了各自的一个峰值，并且极显著的高于后面的浓度处理。在茎尖数中，当不加入TDZ浓度时其达到最大值的2.3，随浓度增加而逐渐减少，并且在0.006mg/L时变为0，且随后在浓度继续增加时再无变化。同样从最大茎长来看，在不加入TDZ时能达到最大值为78.0mm，而后在增加TDZ浓度逐渐升高时最大茎长反而逐渐减少，在0.006mg/L时同样变为0，且在随后的浓度继续增加时也不再变化或变化极小。最后从繁殖系数来观察，当不加入TDZ浓度时繁殖系数能达到最大值的16.8，达到并超过快速繁殖的基本值，而在随后TDZ浓度的逐级增加时变的逐渐减少，在0.006mg/L时同样变为0。综上所述，在R品种下对于各项指标被TDZ的影响下发现，在当不加入TDZ时反而比加入TDZ时要更加容易使其茎段试管苗萌芽的发育和生长，且在0.006mg/L这一浓度下为一个临界线，随着TDZ浓度的增加反而会使蓝莓茎段停止生长和发育，这就表明TDZ对于R品种的影响是有着一定的逆作用，但是如果继续加大TDZ浓度的含量或者浓度从而继续观察R品种各项指标的变化是否有变化是否能够继续生长发育还有待进一步的研究和试验。最后从S品种来观察各项指标在TDZ浓度影响下的不同变化。从茎尖数来看，当不加入TDZ时，茎尖数为最大值的0.8，随着浓度的逐渐增加茎尖数变的逐渐减少，在0.012mg/L时为0，并且在空白对照和0.003mg/L以及0.003和0.006mg/L这两两处理区间内存在显著性差异，在0.006-0.018mg/L时茎尖数不再变化从而也不存在显著性差异了。再而从最大茎长来观测，当不加入TDZ时作为空白对照组的处理反而为最大值的20.4mm，且0和0.003mg/L这两个处理之间不存在着显著性差异，而随着浓度的逐渐增加，最大茎长变化是逐渐减少，且在0.012mg/L时停止茎段的继续生长，并且在0.006-0.018mg/L浓度区间内不再存在显著性差异。最后从繁殖系数来观察，同样是作为空白对照下比较繁殖系数为最大值的3.7，而随着浓度的增加繁殖系数呈现逐渐减少的趋势，且在0.012mg/L浓度下停止生长。综上所述，在S品种下通过不同TDZ浓度对蓝莓茎段各项指标的影响表明，在不加入TDZ时反而使得该品种下的试管苗能够相比于加入TDZ时更好的生长和发育，从而能促进萌芽的生长而达到快速繁殖的一个目的。并且在TDZ浓度为0.012mg/L时使得试管苗停止生长。但是当浓度加到0.018mg/L时各项指标又有一个小浮动的恢复症状，这就有待于后期在继续增大TDZ浓度和含量的同时是否能够继续使得试管苗的发育作为一个研究和试验的基础。3.4 不同TDZ浓度对蓝莓叶片离体培养的影响不同TDZ浓度对同一品种下蓝莓叶片离体培养的实验结果见表4表4 不同TDZ浓度对同一品种下蓝莓叶片离体培养的影响TDZ浓度（mg/L）愈伤组织分化率（%）芽分化率（%）分化芽数（个）00.0030.0060.0120.01810090.090.01001000c23.3bc28.3ab53.3a48.3ab0c0.7b0.97ab1.37a1.5a通过表4我们可以看出在TDZ对于蓝莓叶片离体的影响中，每组处理组合的愈伤组织分化率差异并不是那么显著。添加TDZ的各个处理的愈伤组织分化率在90-100%之间，而未添加TDZ的对照的愈伤组织分化率也高达100%，这表明添加TDZ对蓝莓叶片愈伤组织的分化没有明显的影响。从叶片中芽的分化百分率来观察，随着TDZ浓度的增加，会影响叶片芽的发生并且逐级增长，在0.012mg/L的TDZ浓度时达到最大值的53.3%。同时在0 mg/L、0.003-0.006 mg/L、0.012-0.018 mg/L这三个浓度区间范围内每个区间之间的差异还是显著的，所以表明TDZ对叶片成芽的作用还是客观存在的。从分化芽数来看，随着TDZ浓度的逐渐增加，每一处理的分化芽数随着浓度的增长而成上升趋势，在浓度梯度为0.003-0.012 mg/L这个区间内，通过比较各处理间平均数的显著性差异来看，三个浓度梯度之间达到显著性差异。当TDZ浓度为0.018 mg/L时达最大值时，其分化芽数与0-0.006 mg/L这个浓度区间下存在显著性差异并且达到最大分化数。由此可见， 添加TDZ对于蓝莓试管苗的叶片芽的分化有明显影响，培养基中添加TDZ的浓度为0.012-0.018 mg/L时，叶片上芽的分化率和分化数较高。继续增加TDZ浓度是否能继续促进叶片的愈伤和成芽还有待进一步的试验和研究。3.5 不同品种在TDZ条件下对蓝莓叶片离体培养的影响不同品种下相同TDZ浓度对蓝莓叶片离体的试验结果见表5。表5 不同品种下相同TDZ浓度对蓝莓叶片离体培养的影响蓝莓品种愈伤组织分化率（%）芽分化率（%）分化芽数蓝丰（L）爱国者（A）北陆（B）96.010010035.7a24.0a33.0a1.0a1.08a0.64a由表5可见，在控制TDZ浓度的条件下，来试验不同品种间蓝莓叶片离体培养的影响程度，三个品种间的愈伤组织分化率、芽分化率和分化芽数均没有达到显著性的差异。表明供试的3个蓝莓品种的基因型对叶片离体培养效果无明显影响。3.6 品种与TDZ浓度处理组合对蓝莓叶片离体培养的影响品种与TDZ浓度处理组合对蓝莓叶片离体培养的影响的试验结果见表6。通过表6我们再分别讨论了品种和TDZ浓度处理组合对于蓝莓叶片离体培养的影响，通过继续观察各项指标的数据来分析各处理间的显著性差异。首先在L品种下来看，在随着TDZ浓度的逐渐上升趋势中，愈伤组织分化率的变化是基本均势不变的，只在0.003和0.006mg/L有所下降为90%，但是总体下各处理间还是不存在显著性差异的。其次在芽分化率中可以看到随着TDZ浓度的变化芽的分化率随之增长，且在0.012mg/L时达到最大值的65%，当继续增加TDZ浓度时芽分化率下降到40%，说明在TDZ为0.012mg/L为最适浓度进行培养，高于最适浓度反而会有逆生长现象。从分化芽数来观察，随浓度的增加而增加，同样是在浓度为0.012mg/L时达到峰值为1.6，当继续增加TDZ浓度时分化芽数下降到1.4，但是在0.006-0.018mg/L浓度区间内各处理间不存在显著性差异，而相比较0-0.003mg/L浓度区间内存在着显著性差异。综上所述，在L品种下的TDZ最适浓度为0.012mg/L时，对于各项指标的影响效果是最佳的。其次观察B品种，随着TDZ浓度的逐级增加，愈伤组织分化率呈不变趋势且为100%，说明TDZ对于该品种下的愈伤组织分化影响不明显。其次从芽的分化率来看，随着浓度的逐渐增加，芽分化率是呈现出一个先增后减又增的一个趋势，在浓度为0.012mg/L时达到一个最大值为75%，而后浓度继续增加到0.018mg/L时分化率又下降为55%。从分化芽数观察，在0-0.003mg/L时为上升趋势且处理间存在显著性差异；而在0.003-0.006mg/L时分化芽数有所下降，且处理间存在显著性差异；继续在0.006-0.018mg/L浓度区间内，分化芽数又由下降变为上升趋势，且在浓度为0.018mg/L时达到峰值为2.0，与浓度为0.012mg/L的处理无明显差异，但与其它处理之间存在显著性差异。综上所述，在B品种下的TDZ最适浓度为0.012mg/L时，对于各项指标的影响效果相对于其它处理为最佳。表6 品种与TDZ浓度处理组合对蓝莓叶片离体培养的影响蓝莓品种TDZ含量（mg/L）愈伤组织分化率（%）芽分化率（%）分化芽数（个）蓝丰（L）010000 c蓝丰（L）0.00390250.45 c蓝丰（L）0.00690451.55abc蓝丰（L）0.012100651.6abc蓝丰（L）0.018100401.4abc北陆（B）010000c北陆（B）0.003100250.8bc北陆（B）0.006100100.6c北陆（B）0.012100751.9ab北陆（B）0.018100552.0a爱国者（A）010000c爱国者（A）0.003100200.85abc爱国者（A）0.006100300.75bc爱国者（A）0.012100200.5c爱国者（A）0.018100501.1abc最后分析A品种下随着TDZ浓度的变化反映出各项指标的变化来看，愈伤组织分化率随浓度的增加趋于稳定为100%，与B品种影响效果相同。其次从芽分化率来看，随TDZ浓度的增加而趋于一种稳定的均势变化，在0.018mg/L时达到最大值为50%。最后从分化芽数观测，在刚加入TDZ浓度0.003mg/L时就达到一个较显著的水平0.85，随着继续增加TDZ浓度观察，分化芽数反而逐渐减少，且与0.003mg/L下的处理存在着显著性差异，在0.003-0.012mg/L浓度区间内存在一个下降的趋势且各处理间存在显著性差异；当浓度上升到0.018mg/L时，分化芽数突然升高且达到一个峰值为1.1，且与0.003mg/L浓度下的分化芽数为一个显著水平。综上所述，在A品种下的TDZ浓度当加入量为0.018mg/L时，对于各项指标的影响相比较其他处理是最佳的，也对于该品种下叶片离体培养的影响效果是最好的。4讨论4.1 不同TDZ浓度对蓝莓茎段培养中茎芽增殖的影响 TDZ是一种人工合成的苯基脲衍生物，已被广泛应用于植物组织培养形态发生的高效生物调节剂。它能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能。TDZ在组培中应用广泛，植物中许多生理生化现象受TDZ影响，其主要参与代谢，且主要代谢物为葡萄糖衍生物15。近年来研究初步表明，TDZ是通过调节内源激素起作用，或是诱导胁迫的结果。茎芽增殖是植物组织培养快速繁殖技术的关键环节之一。对于蓝莓试管苗的茎芽增殖有许多研究。龚雪元等利用两种优良成熟蓝莓的茎段腋芽为外植体，研究了基本培养基、植物生长调节剂对诱导蓝莓丛生芽增殖的影响，剪除丛生芽对诱导新一代丛生芽增殖的影响，同时进行了试管微芽的继代增殖培养。目前蓝莓组织培养快速繁殖中的茎芽增殖培养基普遍使用ZT促进芽的萌发，但是ZT价格比较昂贵，寻找ZT的廉价替代品对降低蓝莓试管苗的成本具有一定实际意义。因此，本项研究的目的在于探讨TDZ对于蓝莓茎段茎芽增殖培养的效果，以及TDZ与6-BA及生长素搭配后对蓝莓茎段培养的影响，为降低蓝莓试管苗的培养成本及完善蓝莓茎段培养技术提供依据，同时添加TDZ可以促进北陆蓝莓（B）茎段培养中繁殖系数的提高，但对于瑞卡（R）和斯巴坦（S）品种无效，对其他品种的培养效果有待于继续研究。4.2 不同TDZ浓度对蓝莓离体叶片培养的影响本试验分别以不同浓度TDZ和不同蓝莓品种条件下与IBA和6-BA进行组合，研究其蓝莓叶片离体的培养。叶片培养是培育转基因植物的基础性工作。蓝莓的叶片培养目前已有一些报道。孙阳等在蓝莓品种叶片离体再生及生根技术研究方面，以Sierra、Bluecrop和Toro蓝莓品种试管苗为试材，以改良WMP为基本培养基，研究不同浓度的玉米素和生长素对3个蓝莓品种叶片离体再生分化率及生根速度的影响。结果表明不同品种对于叶片离体再生的能力不同，以Toro叶片再生能力最强，Bluecrop最差，玉米素浓度在0.15mg/L时对蓝莓叶片离体再生效果最佳，而生长素对于蓝莓叶片的再生离体再生影响较小。不同品种之间的叶片生根速率差异也十分显著，当玉米素浓度为0.15mg/L，生长素浓度为0.01mg/L时，三个品种叶片离体再生效果最佳，从而优选出诱导分化率较高的蓝莓品种Toro和Siena。本项试验中将6-BA和IBA分别固定量，然后通过控制不同变量双因素条件下的TDZ浓度和不同品种来观察蓝莓叶片离体培养的最佳TDZ适宜浓度和品种。结果表明，在浓度选择方面最容易产生愈伤叶片并且成芽率最大的为0.012mg/L；在品种选择方面最易使叶片离体生长更多萌芽的为L品种。 在研究外源激素TDZ、ZT及其组合对叶片离体培养的研究方法和试验，近年来也有不少报道，崔光荣等同样以高灌蓝莓试管苗叶片作为外植体，以改良WPM为基本培养基，研究外源激素TDZ,ZT及其组合对离体叶片胚状体发生的影响。结果表明不同浓度的TDZ，ZT以及组合对胚状体的发生频率、丛芽的形成和生长起重要作用，适合高灌蓝莓叶片胚状体发生及成苗的培养WPM+TDZ0.04 mg/L+ZT0.25-2.0 mg/L+蔗糖20-40 g/L，培养基WPM+ZT0.5-1.0 mg/L+蔗糖20 g/L适合于丛芽继代生长。本试验分别以不同浓度TDZ与IBA和6-BA进行组合，显示出对蓝莓叶片培养中芽的分化有明显促进作用，这对于减少ZT用量，降低成本具有积极意义。4.3 不同蓝莓品种对TDZ培养效果的差异性在通过分别讨论了不同浓度对蓝莓茎段和离体叶片培养的影响结果后，我们又在此基础上控制了TDZ浓度的因素，而讨论不同品种对于蓝莓茎段和叶片离体培养的影响。从之前的分析结果也表明，在控制TDZ浓度的条件下分别对蓝莓茎段和叶片离体作为材料，由选出的三个不同品种之间作为比较，并且通过茎段培养的三个指标茎尖数、最大茎长和繁殖系数，以及叶片离体培养的三个指标愈伤组织分化率、芽分化率和分化芽数这几个数据结果分析来综合比较和观察发现，随着TDZ浓度的变化范围内，对于茎段培养时各品种间各项指标间都大大小小的存在着显著性差异，有的甚至会出现处理间的极显著性差异；而在针对叶片离体培养时各品种间各指标间虽然也存在着一些差别不大的显著性差异，但大部分数据结果表明其差异并没有特别明显，这就存在着一个差异性的问题。同样是TDZ浓度对品种的影响，为什么茎段培养的差异性就相对于叶片离体培养的差异性要更大一点，例如在TDZ对不同蓝莓品种茎段的影响中，B品种各项处理指标都达到最佳，并且在繁殖系数方面与其他两个品种之间存在着明显的显著性差异且达到并超过快速繁殖技术的要求。而针对S品种的各项处理指标中相比B、R两个均势品种来讲就没有太大的促进作用，但与其他两个品种间还是存在明显差异。而在TDZ对不同蓝莓品种叶片离体培养的影响中，L、A、B三个品种间从愈伤组织分化率、芽分化率和分化芽数来看都没有在不同浓度下各项指标的影响差异性大，且在愈伤组织分化率上基本趋于相同均势的100%，从而相比较不同品种下蓝莓茎段的培养则呈现出差异性不明显的特征。 因此，在茎段培养中，添加TDZ对北陆品种的茎芽增殖有明显的促进作用，但对于瑞卡和斯巴坦品种则有明显的抑制作用，在叶片培养中，添加TDZ在北陆、蓝丰和爱国者3个品种之间没有明显的差异，对于其他品种对TDZ的反应有待于进一步的研究。5 结论1） 在含有6-BA0.5mg/L和IBA0.1mg/L的WPM培养基中添加TDZ，当TDZ浓度为0.003mg/L时，北陆蓝莓茎段培养的繁殖系数明显提高，达到16.5；TDZ对瑞卡和斯巴坦两个蓝莓品种试管苗的茎芽增殖有明显的抑制作用。 2） 北陆、蓝丰和爱国者3个不同的蓝莓品种的叶片离体培养效果没有表现出明显的差异。当TDZ浓度为0.012mg/L时，蓝丰和北陆蓝莓叶片离体培养结果的各项指标达到最佳，爱国者蓝莓则以TDZ浓度为0.018mg/L效果最佳。【参 考 文 献】1 於红,贺善安,顾姻.我国和世界蓝浆果的发展前景J.植物资源和环境学报,2001,10(2):52-55. 2 容祖,郝瑞.浆果学M. 北京:中国农业出版社,1996:59-89.3 CHANDLER C K,DRAPER A D.Effect on zeatin and 2ip on shoot profiteration ofthree highbush blueberry clones in vitro J. Hortscience,1986,21:1065-1066.4 刘庆忠,赵红军. 高灌蓝莓的组织培养及快速繁殖J. 植物生理学通讯,2002,38(3):253.5 杨艳敏,陶承光,魏永洋,等. 蓝莓组织培养工厂化育苗技术J. 北方园艺, 2012(7):129-131.6 龚雪元,杜亚填,张翔宇,等. 蓝莓丛生芽增殖的诱导研究J.湖南省高校林业资源及化工产业研究院学报,2015(5):53-56.7 沙玉芬,王建萍,李公存,等. 蓝莓茎段组培快繁技术研究J. 山东省烟台市农业科学研究院学报,2015,43(10):27-28.8 廉家盛,朴炫春,廉美兰,等. 培养基种类、玉米素浓度及pH值对蓝莓美登组培增殖生长的影响J. 延边大学农学学报,2010,32(4):33-36.9 李杰,王明莹,黄学文,等. 不同玉米素浓度对蓝莓茎段芽诱导的影响J. 呼伦贝尔学院生命科学学院学报,2013,44 (5):20-2110 孙阳,刘顺标,程淑云,等. 3个蓝莓品种叶片离体再生及生根技术研究J. 安徽农业科学学报,2008,36(11):4411-4412.11 崔广荣,陆峰,曹华龙,等.蓝莓离体叶片胚状体高效发生及其组织学观察J. 激光生物学学报,2008(3):31-36.12 徐晓峰,黄学林. TDZ:一种有效的植物生长调节剂J. 中山大学生命科学学院植物学通报,2003,20(21):227-237.13 陈肖英,叶庆生,刘伟.TDZ研究进展（综述）J. 华南师范大学生命科学学院亚热带植物科学学报,2003,32(3):59-63.14 王洪霞,郭尚敬. TDZ对甜椒不定芽分化的影响J. 北方园艺,2012(3):104-106.15 Mok M C,et al.The metabolism of 14C-TDZ in callus cultures of Phaseolus luntusJ. Physiol Plant,1985,65:427-432.致 谢本试验的论文设计写作是在我的指导老师柴慈江教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。在论文完成之际，在此对论文写作过程中帮助过我的老师和同学表示由衷得感谢。特别要感谢指导老师柴慈江老师，他治学态度严谨，教学指导认真，从试验设计实施到论文写作修改，都给我了极大的帮助和支持，使本论文得以顺利完成。另外，论文的试验工作是和同跟柴老师写作论文的其他同学一起进行的，我们共同完成很多试验工作，并在整个过程中互相交流帮助，在此也要对她们表示诚挚的谢意。附录1：相关英文文献附录2：英文文献中文译文蔗糖水平对蓝莓离体茎芽繁殖和基因向叶片传递的影响曹晓玲， 英格里汉姆，拉里道格拉斯，弗雷迪施拉格水果实验室, USDA/ARS, Beltsville, MD 20705, USA; 动物与鸟类科学系,马里兰大学， College Park, MD 20742-2311, USA (*requests for offprints;传真: 1-301-504-5062; E-mail: )2003年2月2日接受，接受修订为2003年5月12号关键词：杜鹃花科，遗传工程，格斯表达，快速繁殖，越橘蓝莓摘要： 为了提高体外蓝莓（越橘蓝莓L.）拍摄产生的不利影响进而后续基因工程实验，进行了研究，研究蔗糖的影响在增殖介质中的浓度对芽增殖和内含子转移-葡萄糖醛酸酶（格斯）基因的叶子外植体传播的芽。当蔗糖浓度从15mg增加到29、44mg或58mg，蓝丰品种的腋芽在0.5厘米的长度时没有明显增加。当蔗糖浓度分别从15mg增加到44mg，从15mg到58mg时“公爵”和“乔治亚姆”腋芽的数量明显增多。与农杆菌共培养四天，EHA105菌株格斯表达的叶区叶片外植体芽产生最高培养15或29mg的蔗糖浓度。杜克大学和Georgiagem的实验研究表明格斯表达的叶区的数量显著降低叶外植体芽生长在58mg蔗糖比大于15mg蔗糖的所有三个品种的生长，并显著在44mg明显低于15mg的品种。这些研究表明拍摄预处理条件，优化后续蓝莓基因工程实验。因此，蓝莓芽增殖培养基含有15 - 29mg蔗糖是重新供外植体用于遗传转化后。缩写：集落形成单位；GUS -glucuronidase；gusAint -裂解基因在编码区含有内含子；2iP 6-(,-dimethylallylamino)-嘌呤；PPF光合光子通量；玉米素6-(4-羟基-3-甲基-转-2-enylamino)嘌呤。引言成功得被分离的蓝莓基因的功能（2002罗兰和哈默施拉格，）。蓝莓是一种特别适合再生，由于遗传的限制阻碍品种提高基因转移将取决于一个高效的基因delivment通过传统的育种方法（Luby等人非常系统的选择，和高频率根据shootal，1991）。同时，系统的快速体外种植改善目标通过直接基因传播是需要提供足够的数字提供了操作。基因工程或分子工程转化实验。以前的育种技术也在研究重视报道蓝莓茎prolif蓝莓，这些技术有助于阐明操作中包含从15毫米（罗兰和奥格登，1992；曹等人，1998）至88毫米。（齐默尔曼，布鲁姆，1980；沃尔夫等，1983）蔗糖。试图增加芽增殖，但不成功的基因递送费用为蓝莓（曹et al.，1998），本研究的目的是探讨蔗糖浓度对试管苗增殖的影响化和基因传递的叶片外植体在体外支撑先于芽。材料与方法植物材料与枝条培养的维护高丛蓝莓芽CVS文化。蓝丰，公爵和Georgiagem均保持放12厘米长的茎段，在4周的时间间隔，水平在42.5毫升的培养基（行土地和奥格登，1992）组成的木本植物培养基（劳埃德说，1980）作如下修改：6他也中含蔗糖15毫米，D