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转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人：王诗婕 吕晓霞 刘楚怡 一.摘要：本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光；在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。关键字：转基因 斑马鱼 果蝇幼虫二.实验器材与试剂：仪器：试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸；42恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统（CCD）、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。试剂：EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤：转基因斑马鱼构建：1.转染细菌的培养（1）培养基的制备：称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。（2）培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。（3）含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入Amp（氨苄青霉素）储存液,使终浓度为50 g/mL,摇匀后铺板。（4）接种加甘油保存的分别含 质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升（5）37 摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤：（1）. 样本处理：收集已培养1216 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。注：菌液较多时可以通过多次重复离心将菌体收集到1 个离心管中。菌液收集量由菌浓而定，收集菌体过多会反而降低裂解效果。（2）. 悬浮：向菌体沉淀的离心管中加入250ul 溶液，用移液器反复吹打或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（3）. 裂解：加入250ul 溶液于细菌悬液中，温和地上下颠倒68 次，使菌体充分裂解，加1 管混合1 管，确保溶液充分、及时的混匀。充分裂解后的菌液会变得相对粘稠；为防止DNA 断裂，避免剧烈混匀操作及裂解时间过长。（4）. 中和：加入350ul 溶液, 立即温和上下颠倒68 次，充分混匀，加1 管混合1 管。此时会出现白色絮状沉淀，静置2 分钟，12000rpm 离心5分钟（可适当延长至10min）。注：溶液加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。若上清液中仍存在微小白色沉淀，可重复离心后取上清。（5）. 吸附：小心地将上清液转移至吸附柱中，12000rpm离心3060 秒，弃收集管中废液，然后将吸附柱重新套入废液收集管中。若上清一次加不完，可重复操作（转移时不可吸入沉淀，此步很重要）。（6）. 漂洗：向吸附柱中加入600ul 漂洗液PW（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心3060 秒。（7）. 重复步骤6，弃收集管中废液。（8）. 将吸附柱套于收集管中，10000rpm离心2分钟。注：此步骤绝对不可省略，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。（9）. 洗脱：将吸附柱置于一干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央部位悬空滴加50100ul 溶解液TE 或灭菌双蒸水（pH值在7.0-8.5），室温静置210 分钟，12000rpm离心2分钟，即得提取质粒DNA，-20保存。3.将提取出的质粒双酶切，将其线性化并导入荧光蛋白基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，得到一大小为6.0 kb 的带，将起切下纯化并回收。4. 采用光周期诱导方法得到斑马鱼受精卵5.受精后第一次卵裂前进行基因注射，每次注射的DNA溶液约1-2 nL。转基因受精卵置于Holtfreters于室温培养，适时更换培养液，待胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释，发育至心跳期以后，将胚胎转移到暴气的冷开水中培育。6.在480nm激发光照射的荧光倒置显微镜下观察EGFP在转基因斑马鱼胚胎中的表达。果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达1.琼脂板的配置，用1.5%的琼脂配成培养基，倒在垫滤纸培养皿的盖子上。2.将培养的果蝇放飞，留下培养皿的幼虫。3.在解剖镜下，将果蝇培养基里的幼虫按照1龄、2龄、3龄用镊子挑到刚才倒好的3个琼脂培养皿上。4将3个分好类的果蝇幼虫的培养皿拿到显微注射仪下，分别在每只幼虫体内注入一定量的含DFP的DNA。共注射5组，每组含一定量的1龄、2龄、3龄幼虫。5.1、2、4、16、24小时时，分别在荧光显微镜下观察一组的发光情况，记录发光果蝇的数量并拍照。四.试验结果：斑马鱼：在480nm激发光照射的荧光倒置显微镜下观察EGFP在转基因斑马鱼胚胎中的表达。共注射了30个斑马鱼受精卵。胚胎期囊胚后期心动期出苗期发光数1221存活数191365仔鱼由于没有及时更换水而死亡！荧光蛋白基因表达率=注射当日存活的胚胎数/发光的胚胎数x100% =5.26% 图1荧光解剖镜下观察转基因斑马鱼原肠胚 图2荧光解剖镜下观察EGFP在转基因斑马鱼鱼苗多个组织中表达果蝇幼虫：1小时组2小时组4小时组16小时组24小时组1、2龄幼虫发光数122001、2龄幼虫存活数8121078荧光蛋白表达率12.5%16.7%20.0%0%0%（3龄幼虫显微注射完后全部死亡）图3 成功瞬时表达荧光蛋白基因的果蝇（左）与未表达荧光基因的果蝇（右）比较图4荧光解剖镜下观察DFP在果蝇幼虫多个部位表达五.分析与讨论在斑马鱼的转基因实验中，我们发现，质粒的前期转染扩增与线性化及回收很重要，这决定了最终导入还荧光蛋白质粒的纯度和质量，直接影响到了实验的结果。绿色荧光蛋白基因从斑马鱼的原肠胚就开始明显表达，但表达数量很少，从囊胚期一直到出苗期，最多只有1到2尾能观察到荧光，根据胚胎期计算的荧光蛋白基因表达率也只有5.26%。但是，其中成功表达的胚胎一直保持了荧光，并且在鱼苗的多个组织中都发现了有绿色荧光蛋白。这说明，从胚胎期导入的绿色荧光蛋白已经成功的整合进了斑马鱼的DNA中，并可以随着细胞的分裂而遗传下去，在胚胎期成功导入荧光蛋白的细胞，随着细胞分裂及分化，把荧光蛋白基因带到了鱼苗个许多组织器官中，并表达。这也说明，这次转基因至少能较长时间的在斑马鱼体内表达。在果蝇的瞬时表达试验中，通过对果蝇幼虫进行显微注射含DFP荧光蛋白的质粒，其基因也能在其体内表达。3龄幼虫由于体型较大，内细胞分化已经较成熟，显微注射对其造成的损伤也就比较大，所以都没能存活。1、2龄幼虫从1个小时到4个小时之间，均开始表达荧光蛋白基因，在4小时左右，表达数量最多。但之后，并无观察到有荧光蛋白基因表达的幼体了。这是由于荧光蛋白基因在果蝇体内是一个瞬时表达，也就是质粒导入细胞后，并不将其DNA整合到细胞原有的DNA上，而是直接参与转录和翻译，并表达。但是随着细胞的分裂，这些质粒并不能参与DNA的复制，所以不能传递到其它细胞与组织中。原来含质粒的细胞在分裂次数达到极限时，也回衰老死亡。所以在4小时后，所有的荧光基因都不再表达的原因。瞬时表达的特点就是表达的快，注射后1个小时后就开始有明显的荧光蛋白的表达，但消失的也快，到6个小时，荧光已经看不见了。六：实验总结本次实验从斑马鱼和果蝇2个实验材料中，实现了导入荧光蛋白基因并成功表达，一个是长时间表达，并成功整合到其原有DNA上，另一个是基因的瞬时表达，就是不整合到原有DNA上，其表达时间较短