不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究.doc

不同产地桔梗的聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱鉴别研究石俊英， 巩丽丽， 张会敏摘要： 目的 建立不同产地桔梗药材的聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE)指纹图谱鉴别方法。方法 蛋白质( Pro) 、过氧化物酶同工酶( POD) 、酯酶同工酶( EST) PAGE 指纹图谱分析。结果 不同产地桔梗的Pro-PAGE图谱差异极小； POD-PAGE 与EST-PAGE 图谱在谱带分布及数量上均具有显著性差异， 分别具有各自的鉴别谱带。结论 POD-PAGE 与EST-PAGE指纹图谱可作为鉴别不同产地桔梗的有效方法。关键词： 桔梗； 蛋白质-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 过氧化物酶同工酶-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 酯酶同工酶-聚丙烯酰胺凝胶电泳； 指纹图谱中药桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandif lorum ( Jacq) A.DC. 的干燥根 1 ， 具有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效。桔梗是山东的地产药材， 种植历史悠久， 以其产量大、质量好而闻名全国。1991年国际种子检验协会将蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法， 表明了蛋白质电泳方法在干燥种子鉴定和纯度检测中的地位 2 。蛋白质是植物基因表达的产物， 不同的品种、杂交种具有不同的谱带模式， 因而可以将品种区分开来。我们将蛋白质电泳技术应用于中药鉴定， 并做了大量的实验研究 3-7 。为了规范桔梗的栽培技术， 优化道地药材的品种， 进行了不同产地桔梗的可溶性蛋白( Pro)、过氧化物酶( POD )和酯酶同工酶( EST)的聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE指纹图谱分析， 旨在为桔梗的种质资源鉴定和开发提供科学依据。1 仪器、试剂与材料11 仪器DYY -稳流稳压电泳仪( 北京六一仪器厂) ； DYY-28型电泳仪槽( 北京六一仪器厂)；EDAS-290凝胶成像紫外分析仪(北京市新技术应用研究所) ； LGR16-W 高速冷冻离心机(北京医用离心机厂) ； FA1104 型电子天平( 上海天平仪器厂) ； 旋片真空泵( 1 400 rm in-1 ) (浙江黄岩求精真空泵厂)。12 试剂三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N -亚甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、考马斯亮蓝R250、醋酸联苯胺、监牢兰、四甲基乙二胺、溴酚蓝等所用试剂均为分析纯。1.3 实验材料实验样品的产地、采收时间、生长年限等参见表1。经山东中医药大学药学院石俊英教授鉴定为桔梗Platycodon grand if lorum ( Jacq. )A.DC. 。2 方法与结果21 Pro-PAGE 图谱分析211 电泳实验 样品制备、凝胶制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5进行。其中1年生的6个桔梗样品为A 组， 2年生的5个桔梗样品为B组， 分别点于两块电泳凝胶板上。POD-PAGE， EST-PAGE 电泳实验样品分组与此相同。212 Pro-PAGE图谱处理 将脱去底色的样品凝胶板通过凝胶成像紫外分析仪( e lectrophoresis documentat ion and ana lysis system ) 扫描成PAGE 指纹图谱并进行聚类分析， 得PAGE 电泳指纹图谱。各组Pro-PAGE 电泳图谱见图1。22 POD-PAGE 图谱分析221 电泳实验 样品制备、凝胶的制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5 进行。222 POD-PAGE图谱处理 操作同“2.2.1”。各组POD-PAGE图谱见图2。23 EST-PAGE 图谱分析231 电泳实验 样品制备、凝胶的制备、电泳操作、染色与保存参照文献 5 进行。232 EST-PAGE图谱处理 操作同“2.1.2”。各组EST-PAGE图谱见图3。3 讨 论31 由图1 3中的可以看出不同产地桔梗的蛋白质PAGE指纹图谱差异极小， 相同蛋白质条带对应的泳动率差异非常小， 均在系统误差允许范围之内。蛋白质是植物基因表达的产物， 不同的品种、杂交种具有不同的蛋白质谱带模式， 因而可以确定8个不同产地桔梗样品为同一品种。另外， 凝胶板A，B 为不同生长年限桔梗的Pro-PAGE 图谱， 但是Pro-PAGE 指纹图谱一致， 进一步证明遗传物质蛋白质的谱带模式的稳定性。由图1 3中的可以看出11个样品的相似度在95.24% 100%之间， 如果不存在系统误差， 那么样品之间的相似度会更接近100%。由此可见， Pro-PAGE 指纹图谱不能鉴别同一品种的桔梗药材。32 同工酶是基因的直接产物， 能较准确地反应基因的存在状况和表达规律。A， B 两组POD-PAGE，EST-PAGE指纹图谱中各个产地的桔梗药材所含过氧化物酶、酯酶均有所不同， 即可以通过建立不同产地POD-PAGE， EST-PAGE 的指纹图谱来鉴别不同产地桔梗药材。33 蛋白质、酶类都是植物遗传物质的直接表达产物。用Pro-PAGE 电泳指纹图谱可以有效的鉴别植物的品种， 为中药的品种鉴别， 尤其是变种之间的鉴别提供一种可靠、科学的鉴别方法。此外， POD-PAGE， EST-PAGE 指纹图谱又可以用来鉴别不同产地的药材。PAGE 方法具有快速准确、操作简便、稳定性和重现性好等优点， 且实验成本较低， 适合大范围的推广应用。REFERENCES 1 Ch.P ( 2005 ) Vol (中国药典2005 年版一部) S .2005：196. 2 WU M S， WANG S C， DA I JR.App licat ion of f ingerprin t ing techn ique in cu ltivar id ent if icat ion and pu rity test J .J Agric Biotechnol(农业生物技术学报) ， 1998， 6( 1 )： 51-56. 3 SH I JY， YU Y L， LU Y.A pp licat ion of m olecular b iological tech ique in app ais ing variet ies of L onicear ja rp onica J . J Shandong Univ of TCM (山东中医药大学学报) ， 2001， 25 ( 2 ) ： 137-138. 4 SH I J Y， LU Y， LI B W. S tud ies on ident ification of variet ies of Rad ix Glehn iae by gel eletrophores is f ingerp rint J .J Chin Pharm (中国药学杂志) ， 2003，38( 3) ： 171-173. 5 SH I JY， LU Y， XU L C， et a l. Study on the eiectrophoresis fingerprin ts of th ree groups of trad itionalCh inese drugs J .J ChinMed Ma ter (中药材) ， 2002， 25( 12 )： 864-868. 6 LU Y， SH I J Y. S tud ies on ident ification of five prunus by geleletrophores is f ingerp rint J .Shandong Med Ind J (山东医药工业) ， 2002，