lecture 7---NOESY.ppt

NuclearOverhauserEffect NOE NuclearOverhauserEffect NOE AlbertW Overhauser 顺反构型立体构型芳香环的指定 当两个核在空间上很接近时 可以通过偶极 偶极作用相互影响 NOE反应原子核自旋之间通过空间的偶极 偶极相互作用 如果两个1H核间的距离小于5 那么在NMR谱中就可以观察到NOE信号 在蛋白质中也可观察到小于或等于6 的NOE信号 I 1 dij6I 两个1H核间的NOE信号强度dij 两个1H核间的空间距离 NuclearOverhauserEffect NOE NuclearOverhauserEffect NOE 当两个核AX在空间上很接近时 可以通过偶极 偶极作用相互影响 选择A的频率照射 会影响X的能级分布 从而改变其信号强度 NuclearOverhauserEffect NOE W2 W0 单量子数驰豫W1不产生NOE效应 双量子数驰豫W2和零量子数驰豫W0产生NOE效应 小分子运动速度快 采取W2方式 能级 上的分布数量增加 给以足够的时间 能级 上的分布数量也会增加 正向NOE效应大分子运动速度慢 采取W0方式 能级 上的分布数量增加 给以足够的时间 能级 上的分布数量也会增加 反向NOE效应 NuclearOverhauserEffect NOE 当两个核在空间上很接近时 可以通过偶极 偶极作用相互影响 NOE有正负 小分子一般有正向的NOE 大分子有反向的NOE NuclearOverhauserEffect NOE 影响NOE大小的因素 核共振频率v0分子在溶剂中的移动性能tc核间的空间距离 r 6 Me cis 19 Me trans 2 Ha 45 1DNOE 优点 时间短 结果直接可定量缺点 需要分别激发 无法一次得到全部结果需要对NOE有估计 1DNOE 1DNOE 13 15a 12 1415a 15b 14 16 2DNOESY 2DNOESY 2DNOESY 2DNOESY 2DNOESY 8 7 127 18 18 3 5 105 11 16 18 9 10 17 17 10 1611 18 16 14 18 18 13 18 16 14 1713 14 17 17 13 17 17 17 17 2DNOESY 2DNOESY 2DNOESY TOCSY solidlines andNOESY dottedlines AVANCE900 2 0mMLysozymeNOESY NOE实验对环境变化非常敏感 为了得到高质量的谱图 有如下建议1 高质量的样品 样品的分子量最好小于800或者大于2000 不然NOE信号会很小 在这种条件下 最好做ROE实验 2 样品稳定性好 3 高质量的核磁管4 最好预先超声或者通氩气除氧5 NOE实验过程中最好做到恒温 NuclearOverhauserEffect NOE RotatingFrameOverhauserEffectSpectroscopy ROSEY ROESY可以理解为旋转坐标系中的NOE 由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小分子为正 在大分子为负 在中间大小的分子 分子量1000 3000 如小肽接近零 因此中间大小的分子NOE交叉峰非常弱乃至消失 这时可以用ROESY得到距离信息 但是ROESY实验受频偏等因素影响大 而且有一部分反映了耦合关系 难以定量 解析时需要小心 ROSEY 与NOESY的区别 1 分子量在1000 3000范围 建议使用ROESY 小于1000和大于3000的化合物宜做NOESY 2 NOESY是相敏图 在对角峰附近的分辨率较差 3 ROESY得到的都是吸收谱 因此有相信号点 交叉峰 距离对角峰近的可以考虑使用ROESY ROSEY ROSEY TimeDependenceofNOE MixingTimes NOEdynamicallybuildsupandthendecaysduetorelaxationduringthemixingtime 1 smallmolecules0 5 1sec Startwith0 5sec 2 mediumsizemolecules0 1 0 5sec Startwith0 25sec 3 largemolecules0 05 0 2sec Startwith0 1sec 同一分子中不同的NOE关系 其混合时间略有不同 如果要得到完美的NOE谱 需要采用不同的混合时间做一系列谱 一般情况下选择0 3 0 5sec 关于NOE的几点注意 1 为测定NOE 需要对样品的核磁谱图有准确的指认 最常用的是同核NOE 故需要指认好氢谱 2 NOE的测定有一维谱和二维谱两大类 一维谱是作NOE的差谱 二维谱的方式即测NOESY或ROESY 3 NOE的具体数值除和研究的分子密切相关外 也和仪器 工作频率 实验条件等有关 因而准确性和相互可比性不够好 4 NOE信息的价值与两个相关的磁性核跨越的化学键的数目有关 当两核越是跨越了多根化学键还显示NOE时 这越能排除相对多的构型 构象可能性 因而较重要的立体化学信息 5 在应用NOE时 常有某些预定的分子模型 根据NOE的结果可以从中作出明确的抉择 关于NOE的几点注意 6 NOE最适合刚性分子 在这种情况下 核组之间具有确定的距离 7 若样品为柔性分子 相对于核磁共振的时标 分子在溶液中存在较快的构象互变 NOE测定的是一个平均结果 因而无法得到具体的构象信息 此时可以考虑下列方法 1 作变温实验 使体系温度降低 如果样品在溶液中有优势构象 可能得到NOE结果 2 加入使溶液变稠的物质 如SDS 十二烷基磺酸钠 使得构象转换的速率降低 3 将样品分子作化学修饰 即将其结构稍加变化以便测定NOE 其它种类的二维核磁 HOHAHA 同核全相关谱 测定样品分子中所有偶合质子关系的化学位移相关谱 GHSQC 检测1H的梯度增益异核单量子相关谱 测定样品分子中 碳氢的直接相连关系 COLOC 检测1H的异核远程相关谱 测定样品分子中 中远程碳氢相关关系 INADEQUATE 低丰度核双量子跃迁实验 测定样品分子中 低丰度核的相关关系 常见核磁原子核的化学位移范围 1HTMS0 1513CTMS0 22015NNH3 l 0 90017OH2O 50 170019FCFCl3 280 25029SiTMS 380 8031P85 H3PO4 480 270 14Nand15NNMR 15N能够产生很尖锐的核磁信号 但灵敏度很低 14N灵敏度相对较高但核磁信号峰非常宽 以至于在很多情况下无法分析 14Nand15NNMR 14NNMR I 1Naturalabundance99 63 ReferencecompoundNH3liquidReceptivityrel to1Hatnaturalabundance1 01 10 3Receptivityrel to13Catnaturalabundance5 74 14NNMR 14N的高对称性小分子的信号宽度一般在几十或几十赫兹的范围内 而不对称的大分子的峰宽可能达到1000赫兹上下 因此一般用来区分很小的分子和N2 15NNMR 15N的灵敏度非常低 但可以得到尖锐的信号 一般使用很大浓度的溶液或同位素标定的化合物进行研究 驰豫时间一般很长 几十秒 需要长的d1 或添加驰豫试剂 I 1 2Naturalabundance0 37 Referencecompound90 CH3NO2inCDCl3orliquidNH3Receptivityrel to1Hatnaturalabundance3 85 10 6Receptivityrel to13Catnaturalabundance0 0219 15NNMR 15NNMRspectrumofsodiumazide 1M inD2O 15NNMRspectrumofenrichedHIV 1protease 31PNMR I 1 2Naturalabundance100 Referencecompound85 H3PO4inH2O 0ppmReceptivityrel to1Hatnaturalabundance6 67 10 3Receptivityrel to13Catnaturalabundance37 7 化学位移值交叉 规律性不强 要多查阅文献数据 PBu3 32 5ppmPiBu3 45 3ppmPsBu37 9ppmPtBu363ppm 31PNMR 与质子的耦合使峰变宽 一键耦合常数为200 700Hz 二键耦合常数为0 5 20Hz 29SiNMR 29SiNMR TMS SiHCl3 一键耦合常数一般在几百赫兹的级别上 二键耦合常数为6 6Hz 29Si NMRspectrumofTMSinCDCl3 19FNMR I 1 2Naturalabundance100 ReferencecompoundCFCl3 0ppm CF3COOH 78 5ppmReceptivityrel to1Hatnaturalabundance0 83Receptivityrel to13Catnaturalabundance4716 19FNMR 金属有机核磁 Organolithium 6Li Q 8 0 10 4a 7 4 I 16Li Higherresolution7Li Q 4 5 10 2a 92 6 I 3 27Li HighersensitivityRef 1Mor0 1MLiClinD2O 金属有机核磁 Boron 10B Q 8 5 10 2a 19 6