2章菌种110905.ppt

第二章菌种分离 选育和保藏 第一节菌种的分离筛选第二节培养分离第三节工业微生物育种第四节菌种的保藏 第一节工业菌种的获得 菌种的来源 直接购买 筛选与驯化 购买 根据资料直接向有关科研单位 高等院校 工厂或菌种保藏部门索取或购买 筛选 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 发酵工业对菌种的要求 利用廉价的培养基 目的产物产量高 易回收 生长快 发酵周期短 培养条件易于控制 抗噬菌体及杂菌污染能力强 菌种不易退化 发酵生产和产品质量稳定性 不是病原菌 不产生任何有害的活性物质或毒素 二 分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求 菌种的特性 采用各种快速 准确 有效地对菌种进行分离和筛选 筛选方法非常重要 设计选择方案2点注意 方法的选择性和灵敏度 三 菌种分离与筛选的步骤 确定方案 首先要查阅资料 了解所需菌种的生长培养特性 采样 增殖 分离 发酵性能测定 菌种筛选主要步骤 调查研究及查阅资料 设计实验方案 确定采集样品的生态环境采样 确定特定的增殖条件增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法平板分离 原种斜面 确定发酵培养基础条件初筛 复筛 结合初步工艺条件摸索单株纯种分离 生产性能试验 毒性试验菌种鉴定 用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株 一 采样 1 采样对象以采集土壤为主 细菌和放线菌 田园土和耕作过的沼泽土中 酵母和霉菌 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中较多 如一些野果生长区和果园内 2 采样季节3 采土方式 取离地面5 15cm处的土约10g 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 扎好 标记 记录 从自然界筛选 二 增殖培养 为了容易分离到所需的菌种 让无关的微生物至少是在数量上不要增加 可以对样品预处理 物理 化学 或配制选择性培养基 例如碳源利用的控制 可选定糖 淀粉 纤维素 或者石油等 以其中的一种为唯一碳源 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长 而其它微生物就可能死亡或淘汰 三 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著 但还是处于微生物的混杂生长状态 因此还必须分离 纯化 在这一步 增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用 纯种分离的方法有划线分离法 稀释分离法 2 平皿划线分离法a 分区划线分离法b 连续划线分离法 微生物的特点 形态 2 平皿反应快速检出法 定性或半定量 1 透明圈法根据琼脂培养上透明圈 菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈 淀粉酶碳酸钙平板透明圈 产酸酪素 蛋白 透明圈 蛋白酶 2 变色圈法 直接用显色剂或指示剂 刚果红染色 3 抑制圈 适用 抗生素产生菌的选育工具菌 对目的抗生素敏感的微生物例 获抗G 菌抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法代谢物积累 用打孔器 3CM 将菌落连同周围琼脂培养基一起取下 放一无菌空培养皿内 保湿培养4 5天 使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定 取107工具菌涂布于琼脂培养基 将小琼脂块放于上面培养过夜 抑菌圈的出现 说明琼脂块中有抗生素 大小说明抗生素单位的高低 抗生素筛选 目前 人们可以利用的微生物只占自然界的1 左右 已经证明大量的微生物在人工合成的培养基上无法生长 这就迫切要求不依赖于微生物培养而能进行微生物研究的新技术出现 未培养微生物 2种研究方法 模拟自然培养法和宏基因组分析 模拟自然培养法 模拟微生物生长的自然环境对未培养微生物进行培养研究 主要集中在原位培养 培养条件的优化 单细胞微操作的研究 宏基因组分析 Handelsman 1998 依据基因或基因组 蛋白序列 以及调节表达机制构建高效表达的工程菌株 不经纯培养也可以获得菌的信息 未培养微生物Unculturedbacterium a 双层平板 b 单层平板微生物在不同氧气状况下对滤纸分解情况 a b 宏基因组分析法 宏基因组分析法 直接依据基因或基因组 蛋白质序列 以及调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用 该微生物的16SrDNA克隆文库建库图 说明 全面了解该复合系全部菌种组成 需要在厌氧条件下分离 纯化每个厌氧菌 因此彻底了解每株菌获得相应信息还存在很大的难度 说明复合系既是一个菌种组成多样性丰富的群体 又是一个发现新种的良好素材 厌氧微生物的培养基制作 1 去除培养基中的溶解氧 降低Eh 氧化还原电位 煮沸法 将培养基置煮沸15分钟 驱除其中的溶解氧 勿再摇动 Eh可降至0 1V以下培养基预还原 加入半胱氨酸 巯基化生物 Na2S 抗坏血酸等降低Eh 刃天青是一种氧化还原指示剂 在无氧条件下呈无色 氧化后呈红色 从而指示出培养基的氧化程度 百万分之一的浓度 2 创造无氧环境物理除氧空气置换法 干燥器或厌氧培养罐抽真空76mmHg 充入N2 充入CO210 H210 N280 化学除氧H2 O2 H2O 钯作催化剂 Gaspak罐除氧 硼氢化钠 柠檬酸 碳酸氢钠化学反应产生H2和CO2 H2与O2反应生成水 3 厌氧分离 培养 设备高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术 GasPak 厌氧培养装置 厌氧手套箱 好氧培养培养装置 德国科学家H N Schulz等1999年在纳米比亚海岸的海底沉积物中发现的一种硫细菌 sulfurbacterium 其大小可达0 75mm Thiomargaritanamibiensis 纳米比亚硫磺珍珠 从永冻冰层分离微生物 四 扩大培养 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件 通过三角瓶进行小型发酵试验 以求得适合于工业生产用菌种 五 毒性试验 某些微生物是在一定条件下次生代谢产物是有毒的 将其作为生产菌种应十分当心 微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草芽孢杆菌作为食用无须作毒性试验外 其他微生物作为食用 一般需通过两年以上的毒性试验 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素是生长在食物及饲料上的黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物 致癌 黄曲霉毒性的致癌性极强 除极易导致肝癌外 由于给毒途径不同 还可引起肾 胃 支气管 腺体和皮下组织的癌肿 致畸 4mg kg 1次 妊娠地鼠腹腔有致畸现象 致突变 典曲霉毒素B1可使动植物细胞染色体畸变带有桥 染色单体桥和染色单体断裂及DNA断裂 二 放线菌的分离 除嗜温性放线菌外 其他放线菌一般培养4 20d在分离平板上缓慢形成菌落 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂抑制霉菌素或放线菌酮 以抑制真菌的繁殖 次代培养及纯化 菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异 作初步的鉴定和区分镜检 放线菌菌落形态 三 真菌分离 1 利用低C N比的培养基可使真菌生长菌落分散 利于计数 分离和鉴定 2 有时 真菌子实体形成必须有光线 这在分离培养时应加以考虑 3 加抗生素抑制细菌 四 生产选种 生产实践中 发现某些批次产量提高 这就有可能是个别批次菌发生自然突变 显示优良的生产性能 应对该批次微生物进行菌种保存 并试验检测其生产性能 自然突变发生频率10 5 10 8诱变育种发生频率10 3 10 6 发酵工业菌种改良目的 微生物本身的代谢机制导致其本身不会过多的产生某种产物 野生型菌株无法满足生产需要 育种工作是在不损害其基本生命活性的前提下改变代谢机制 使微生物按照人类的设计 最大限度的积累目标产物 实现过量生产产品的目的 第三节工业微生物育种 优良的生产菌种具备的基本特性 具有短发酵周期内生产大量发酵产物的能力 不生产或少生产副产物或与目标产物相近的副产物 繁殖能力和生长速率高 产孢能力强 能够利用低廉的原料 产生气泡少 具有抗噬菌体的能力 遗传特性稳定 选择育种方法时综合考虑的因素 特定菌种的基本性状及其工艺不了解 多采用随机诱变 筛选及选育等技术 对其遗传及生物化学方面性状已有较深认识 可选择基因重组等手段进行定向育种 一 诱变育种 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高 一个基因的自然突变频率仅10 5 10 8左右 诱变育种是迄今为止国内外提高菌种产量 性能的主要手段 诱变育种 利用诱变剂处理微生物细胞 提高基因突变频率 再通过合适的筛选办法获得所需的高产优质菌种的方法 基本原理 诱变的基础是基因突变 即DNA分子结构中某一部位发生变化 由各种物理 化学 生物因素人工诱发基因突变 引起微生物的遗传变异 可使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到提高 从而使筛选获得优良特性的变异菌株 速度快 收效大 方法简便的优点 但是诱发突变缺乏定向性 一 诱变剂和诱变处理 物理诱变剂 射线如紫外线 X 射线 射线 快中子等 使用得最方便而且十分有效的是紫外线 许多高产菌株的选育都用过紫外线 对一般实验室 中小型工厂都适用 也很安全 其他的几种射线都是电离性质的 有一定的穿透力 一般都由专业人员在专门的设备中使用 否则有一定危险性 超净工作台 小型X射线衍射仪 Co60射线机 化学诱变剂 化学诱变剂 碱基类似物 5 氟尿嘧啶 烷化剂等 其中使用最多 最有效的是烷化剂 优点 就突变数量和效果而言 要比电离辐射更有效 从经济学角度来讲 诱变剂是经济的 缺点 大部分诱变剂是致癌剂 诱变剂的种类及其名称 诱变剂的选择 1 亚硝酸和烷化剂应用较广 造成的遗传损伤较多 亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 超诱变剂 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一 2 紫外线诱变十分有效 电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂 但它可能影响邻近基因的功能 3 联合使用 诱变剂复合处理的协同效应 以选育高产突变株为例 3 诱变育种的步骤 4 分离和筛选 航天育种 航天育种即利用宇宙空间环境高真空 微重力和强辐射的特点 在宇宙射线辐射的作用下 使生物的遗传性状发生变异 从而选育出优良菌种 这种太空南瓜王最大能长到200多公斤 在生长繁殖期高峰时 南瓜每天能增大5公斤 太空南瓜王 二 诱变育种步骤 1 出发菌株的选择2 处理菌悬液的制备3 诱变处理4 中间培养5 分离和筛选 1 出发菌株的选择 1 新分离的野生型菌株 对诱变处理较敏感 容易达到好的效果 2 生产选种的菌株与野生型较相像 也是良好的出发菌株 3 经多次诱变处理都有一定提高的菌株 4 选择单倍体细胞 单核或核少的菌体作诱变细胞 这是由于变异性状大部分是隐性的 特别是高产基因 5 据诱变剂 细胞生理状态 诱变谱选择诱变方法 同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性 使诱变效果下降 时间选择 诱变剂作用于营养细胞的 要选对数期的细胞 有的作用于休止期 就可选用孢子 2 处理菌悬液的制备 步骤的关键是制备均匀状态的单细胞和单孢子菌悬液 为此要进行合适培养基的培养 并要离心 洗涤 过滤 带玻璃珠的三角瓶内 加无菌水 紫外线诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯 波长为2537 距离为15 30cm 照射时间依菌种而异 一般我们常以细胞的死亡率表示 照射剂量死亡率在80 以上 根据有关诱变剂及诱变处理的介绍 结合诱变对象的实际 设计诱变处理方案 3 诱变处理 二 操作步骤1 将培养液以3000r min离心5min 去上清 菌体打散 加入无菌生理盐水 多次离心洗涤 2 菌悬液放入有玻璃珠的三角瓶内摇动打散菌体 定性滤纸过滤 核酸蛋白仪测定细胞数108个 ml 作为待处理菌悬液 3 取2 4m1制备的菌液在d 9cm培养皿内 置磁力搅拌器上 15W紫外线下30cm处 照射前 先开紫外10min 让紫外灯预热 然后开启皿盖正式在搅拌下照射10 50s 4 取未照射的菌液和照射菌液各0 5ml进行稀释分离 计数活菌细胞数 5 取照射菌液2ml于液体培养基中 120r min振荡培养4 6h 6 取中间培养液稀释分离 培养 7 挑取菌落进行筛选 一般微生物中都存在光复活作用 利用UV进行诱变育种工作时 应在红光下进行照射和后续操作 并放置在黑暗条件下培养 注意 光复活作用 把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时 可明显降低其死亡率的现象 称为光复活作用 4 中间培养 中间培养 发生突变尚未表现出来前 有一个表现延迟的过程 需3代或以上繁殖才能将突变性状表现出来 此过程称为中间培养 该过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的 方法 将变异处理后的细胞放在液体培养基中培养几小时 让细胞的遗传物质复制 让细胞繁殖3代以上 以得到纯的变异细胞 设计简便 高效的科学筛选方案 初筛 筛选工作 复筛 以量为主 除去对生产无效的菌株 以质为主 对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定 5 分离和筛选 诱变筛选分两个阶段 初筛和复筛 初筛 利用鉴别性培养基的原理 有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为 可视化 将90 菌落淘汰 复筛 主要根据生产性能进行筛选 初筛 复筛 对产量突变株生产性能的测定方法 粗测为主 在培养皿平板上 在摇瓶中 较精确的测定 摇瓶培养or台式自控发酵罐培养 在培养皿平板上 通过观察测定某突变菌落周围淀粉酶变色圈 用碘液使淀粉显色 的大小 柠檬酸变色圈 可在厚滤纸上培养 用溴甲酚绿作指示剂 的大小 抗生素抑制圈的大小 指示菌生长圈的大小 测定生长因子产生 纤维素酶对纤维素水解圈 用刚果红染色 的大小 外毒素的沉淀反应圈的大小等 初筛 在诱变种 营养缺陷型突变株 auxotrophicmutant 在生物学 应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义 1 营养缺陷型 auxotroph 某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子 碱基或氨基酸的能力 只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物 precursor 才能正常生长繁殖的变异类型 称为营养缺陷型 在诱变种 营养缺陷型突变株 auxotrophicmutant 在生物学 应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义 原养型 prototroph 与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体 野生型 wildtype wildstrain 营养缺陷型 auxotroph 从自然界分离到的原始菌株 经诱变剂处理后的突变株 突变株经回复突变或重组后产生的菌株 a 基本培养基 MM minimalmedium 与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基 称MM b 完全培养基 completemedium CM 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基 称为CM 一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸 维生素 核苷酸和碱基之类的天然物质 如蛋白胨或酵母膏等配制而成 c 补充培养基 supplementalmedium SM 凡只能满足某种或某类营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基 称为SM 在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成 可专门选择相应的突变株 营养缺陷型的筛选方法 第一步 诱变剂处理 化学 物理 第二步 淘汰野生型第三步 检出缺陷型第四步 鉴定缺陷型 二 淘汰野生型 抗生素法 野生型能在基本培养基上 MM 生长 而缺陷型不能 添加抗生素在MM中 野生型在MM上生长 处于活化阶段 而缺陷型无法生长 仍处于休眠状态 抗生素将活化状态的野生型杀死 获得了缺陷型 细菌采用青霉素 酵母可采用制霉菌素 菌丝过滤法 对于霉菌 因孢子生长后会长出菌丝体 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去 而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过 三 检出缺陷型 原理 根据菌体在基本培养基和完全培养基上 生长情况不同 缺陷型在CM 完全培养基 上生长良好 而在MM上则不生长 野生型都能生长 具体方法 点种法 影印平板法 夹层法 点种法 影印平板培养法 夹层法 营养缺陷型的应用实例 1 氨基酸发酵生产 三 基因工程技术 基因重组育种 是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因 再借助于病毒 细菌质粒或其他载体 将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达 通过细胞间的相互作用 使一个细胞的优良性状经其间遗传物质的交换而转移给另 个细胞的方法 基因克隆过程包括以下步骤 获得待克隆的DNA片段 基因 目的基因与载体在体外连接 重组DNA分子导入宿主细胞 筛选 鉴定阳性重组子 重组子的扩增与表达 PCRreaction100ul community 30ul EtOHconcentration Agarosegel Exercisetheproposedband Gelpurificationkit 30ul 4ul EtOHconcentration 转化到E coliJM109 质粒扩增 复合系与筛选克隆DGGE 送出测序 DNA的纯化 构建克隆文库 制备感受态细胞 通过pGEM Teasyvectorsystem将DNA与载体连接 涂平板 蓝白筛选选出白色菌落白色菌落代表正确的insert 将白色菌落转移在新plate 并编码 建立DNA克隆文库方法流程图 筛选目的克隆 菌落PCR 10个一组PCR DGGE选出代表性的clone组 对组内克隆DGGE 确定需要测序的clone 排除重复测序 该微生物的16SrDNA克隆文库建库图 目的基因的获取 一 通过建立基因文库分离靶基因二 化学合成法制备DNA片段三 聚合酶链式反应法扩增基因片段 微生物基因工程的实例 人类胰岛素的制备 DNA片断的克隆 载体 vector 是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA 一般是通过改造质粒 噬菌体或病毒等构建的 DNA分子的体外连接 是重组DNA技术的关键 DNA连接是由DNA连接酶催化完成的 宿主菌 体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制 增殖和表达 根据所采用的载体的性质导入受体方法 如转化 转染 重组克隆的筛选与鉴定 从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落 并鉴定重组子的正确性 通过细菌培养以及重组子的扩增 获得所需的基因片段的大量拷贝 进一步研究该基因的结构 功能 或表达该基因的产物 工程菌的稳定性问题 生产中 有质粒的工程菌生长状况不如无质粒的宿主细胞 使发酵受到影响 产量降低 不稳定性表现为 质粒丢失 重组质粒发生DNA片断脱落 表达产物不稳定 控制外源基因过量表达 外源基因表达水平越高 重组质粒往往越不稳定 控制培养条件 这是工业化生产的关键步骤 将质粒上的不需要的DNA部分除去 采取以下措施来防止或降低工程菌的不稳定 组建合适载体 选择适当的宿主 重组质粒在大肠杆菌中的稳定性大于枯草芽孢杆菌和酵母 施加选择压力 即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长 常用方法有抗生素添加法 营养缺陷型法等 四 原生质体育种 原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法 原生质体 原生质体融合 通过人为的方法 使遗传性状不同两个细胞的原生质体进行融合 获得兼有双亲遗传性状稳定重组子的过程 称为原生质体融合 获得的重组子 成为融合子 fusant 一 原生质体融合育种的特点 1 原生质体融合重组率大于10 1 诱变育种为10 6 2 受接合型或致育型的限制较小 任何一株都能起受体或供体作用 而且不同的属间 科间 菌株间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合 以期达到生产性状更为优良的新物种 3 遗传物质传递更为完整 原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行的合二为一的过程 选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本 脱壁酶 细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理 真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等 离心聚集 在高渗溶液中稀释 加入促融合剂或电脉冲 各种选择性培养基 二 原生质体融合的主要步骤 三 原生质体融合育种的要点 一 标记菌种的选择获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种 筛选出营养缺陷型或抗药性菌株 这里最重要的是标记必须稳定 采用抗药性菌株除可作标记外 在实验室中还可排除杂菌污染的干扰 为的是确证融合的成功 可以采用多标记菌种 二 原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶 将细胞壁分离剥离 剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞 它保持原细胞的一切活性 影响原生质体制备的因素 1 菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些 可将菌作一些前处理 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素 2 菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化 一般选择增殖期的菌体 3 酶浓度 对于不同种属的微生物 不仅对酶的种类要求不同 就是对酶的浓度也有差异 另外 最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化 4 酶处理温度 20 40 5 渗透压稳定剂 渗透压在原生质体制备中 不仅起到保护原生质体免于膨裂 而且还有助于酶和底物的结合 渗透压稳定剂多采用甘露醇 山梨醇 蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物 6 原生质体再生 重新构建细胞壁 恢复细胞完整形态并能够生长和分裂 原生质体融合选育优良菌株实例 酿酒酵母和糖化酵母原生质体融合产生课利用淀粉和糊精的酵母融合子 地衣芽孢杆菌产蛋白酶 对噬菌体敏感 将与抗噬菌体菌株进行融合 获抗噬菌体高产蛋白酶菌株 一 菌种的衰退与保藏 一 衰退1 定义 衰退 degeneration 指由于自发突变的结果 某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象 菌种的衰退是发生在微生物细胞群中的一个由量变到质变的逐步演化过程 第三节菌种保藏 菌种的性状稳定是微生物学工作最重要的基本要求 否则生产或科研都无法正常进行 菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化 这种变异也称负变 minusmutation 影响微生物菌种稳定性的因素 a 变异 b 污染 c 死亡 例如 微生物菌落形态或个体形态的变化 生长速度缓慢 产孢子量减少 色素产生情况的变化 研究菌种遗传标记的丢失 生产菌种生产性状的劣化等 衰退的原因 造成菌种退化的主要原因是基因突变 生产工艺条件控制不当 杂菌污染 造成生产性能下降 饰变 2 菌种保藏的方法 一种良好的菌种保藏方法 保持原菌的优良性状长期稳定 方法的通用性 操作的简便性 设备的普及性 1 定期移植保藏法