反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法中常见的污染问题及对策.docx

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法中常见的污染问题及对策反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来RT-PCR技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR实验方法过程中出现的一些常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。 RT-PCR实验有三步：提取RNA、反转录（RT）、PCR扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面：1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180的高温下干烤6小时或更长时间；样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。2、RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做RT-PCR实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一RT-PCR试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。4、操作人员污染只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。任一种科学的实验方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR方法也不例外，在检测质量能保证的情况下，若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都能对防止污染有利。总之，RT-PCR不管从特异性方