细胞生物学实验.doc

1、渗透压：水从低渗溶液穿过半透膜进入高渗溶液时产生的压力。溶液促使膜外水分子向内渗透的力量即为渗透压。以血浆的正常渗透压(7.6个大气压或5776毫米汞柱)为标准，与血浆正常渗透压很相似的溶液成为等渗溶液，高于血浆正常渗透压的溶液成为高渗溶液，低于血浆正常渗透压的溶液则称为低渗溶液。高渗：体内的渗透压高于体外，水由环境中向体内扩散，体内的盐分向外扩散。通过排泄作用排出多余的水，盐分通过食物和组织摄入。低渗：体内的渗透压低于体外，水由体内向环境中扩散，环境中的盐分向内扩散。水和钠同时缺失，但缺水少于缺钠，血清钠低于正常范围，细胞外液呈低渗状态细胞膜吸收：疏水的小分子或小的不带电电荷的极性分子（简单扩散），水分子（水孔蛋白），各种极性分子和无机离子（协助扩散）细胞膜屏蔽哪些：盐、无机离子、极性大分子。允许进入：脂溶性、水、非极性、有机小分子、NH4+氯化钠+稀释羊血不溶血氯化铵+稀释羊血溶血醋酸铵+稀释羊血溶血硝酸钠不溶血草酸铵溶血硫酸钠不溶血葡萄糖不溶血甘油溶血极性小分子乙醇溶血极性小分子丙酮溶血疏水性分子2、凝集素：一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。血细胞浓度越大，细胞凝集的时间越短，凝集现象也越明显。3、荧光：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。自发荧光：有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光。如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。次生荧光：有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。差速离心：利用不同物质沉降速率的差异，在不同离心速度下分离和收集不同颗粒的离心技术。常用于分离细胞匀浆中的各种细胞器。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。显微镜的区别：暗视野：外部轮廓，运动；相差：细胞器，内部结构；扫描电子：表面特征离心方法：差速离心、速率区带离心法、等密度离心法、叶绿体分离与荧光观察 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法（先1000r/min 2min弃沉淀再3000r/min5min 弃上清）4、活体染色：指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。主要染料：詹纳斯绿B（线粒体）和中性红（液泡系，即高尔基体）酸性染料：这类染料电离后染料离子带负电，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。（具体有伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等染料）碱性染料：这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐。（具体有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红，詹纳斯绿b和中性红等碱性染料）詹纳斯绿B：是线粒体专一性活性染色剂，是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈蓝绿色，而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基。中性红：为弱碱性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色。5、细胞骨架：真核细胞中与保持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络。包括微管、微丝和中间丝。TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。M-缓冲液：染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。6、DNA染色原理：DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff（无色品红亚硫酸溶液）试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基，醌基是一个具有颜色的发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen的专一性。Schiff试剂：先将200ml蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g，充分搅拌，有助于溶解。待溶液冷到50时，过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1mol/L HCl 20ml，冷却到25时加入1g偏亚硫酸钾（K2S2O5）或偏亚硫酸钠（NaS2O5）充分振荡后盖紧瓶塞，放于暗处过夜。次日取出，呈淡黄色或近于无色，加中性活性炭一匙，约0.5g，剧烈振荡1 min，过滤后即得无色品红。无色品红配成后须塞紧瓶塞。外包黑布或黑纸，贮存在冰箱或黑箱低温处。7、细胞培养：在实验室中用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。组织培养：从机体分离出的组织或细胞在体外人工条件下培养生长的技术。原代细胞培养：直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。传代细胞培养：指从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代 或传代培养。动物细胞培养培养基特点：液体培养基，含动物血清，无毒（EMEM+血清+双抗）一般用酚红作为Ph指示剂。胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。8、PEG融合：PEG分子量及浓度，作用时间，作用温度，细胞种类和浓度，以及PH值。（PEG分子量一般为4000和6000，体积分数为50%，PH为6.0，Ca2+为50mmol/mL）9、流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。原理：待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。 对细胞进行分选的原理是，由超声振荡器产生高频振荡，使流动室发生振动，把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴，有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前，光学系统已测定了它们的信号（代表细胞的性质），如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合，或者说，如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时，仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定细胞的液滴就带有电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转，从而达到了分类收集细胞的目的流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。 作用：1、计数2、测细胞周期3、测特异性蛋白作用：细胞周期分析，细胞凋亡分析，人外周血淋巴细胞亚群检测。影响因素：1、样品处理，去除杂细胞、碎片等对正常细胞的计数；2、对照：设立负对照、同型对照、弱阳性对照，帮助你正确判断阴阳的界定；3、正确的补偿；4、正确的染色方法，抗体的比例，染色步骤，固定等都会影响结果，虽然有的影响很小；5、抗体的搭配，主要是荧光素的搭配，以及好的克隆号；6、机器的校验，但通常很少有人会天天校正机器；7、对细胞的处理，这里说的是培养的细胞。比如培养前数目是否一致，药物量是否有可比性。流式的一个缺点就是移植性，机器、抗体、操作者等不同会影响结果，说明它的标准性欠缺，对人员有一定要求10、微核：细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞质中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形核。1. 传代细胞培养：是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移接种到另一培养瓶的培养。原理：1.细胞骨架原理 细胞骨架是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。根据蛋白质纤维的直径，组成成分和组装结构的不同可分为微丝微管和中等纤维，其对于维持细胞的形态结构及细胞运动物质运输，能量转换，信号传导和细胞分裂等有重要的作用，本实验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料，可将细胞膜的膜结构和大部分蛋白质抽提调，但细胞骨架系统蛋白却被保存下来，后者用R250染色在光学显微镜下可见一种网状结构。什么叫做PBS：PBS溶液又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择K2HPO4和KH2PO4配制，因为钠盐溶解的较慢。根据不同pH的溶液，称量不同质量的磷酸盐，也可以用pH计调溶液的pH。PBS一般用作支持电解质。为什么用TritonX-100不用SDS去垢剂可分为离子型和非离子型两种。SDS是常用的离子型去垢剂，它不仅可使细胞膜崩溃，并与膜蛋白的疏水部分结合使其分离，而且还破坏膜蛋白内部的非共价键，使蛋白变性，所以不宜用于分离膜蛋白。TritonX是一种非离子型去垢剂，属温和性去垢剂，可以使膜溶解，又不使蛋白变性，可分离到有生物活性的膜蛋白。PBS作用：PH保证、与细胞渗透压相近。戊二醛作用：固定蛋白，保证细胞形状。考马斯亮蓝R250作用:与蛋白特异性结合。2细胞凝集反应: 在某一种蛋白如土豆中，有多个位点可以与其他细胞结合，而且蛋白之间可以聚集，使多个细胞聚集在一起。以PBS液加2%血细胞液作对照试验因为太稀不容易使红细胞凝集，太浓分辨不出来是自身堆积在一起还是由于凝集素使其凝集在一起。3.亚硫酸配制：10%偏重亚硫酸钠水溶液5ml。蒸馏水100ml。1mol/LHCL5ml。4.传代细胞培养原理 第一步制备细胞悬液，当细胞生长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA所破坏。因为EDTA对钙、镁离子具亲和力，而这两种离子又是细胞保持紧密结合所必需的因素。所以一般采用胰蛋白酶和EDTA的混合物，作为消化液。培养基用EMEM液(90%)犊牛血清(10%)双抗、3%谷氨酰胺1ml、7.4%NaHCO3（PH7.07.2）.其核心是培养基与消化液（0.02%EDTA或0.004%EDTA+0.5%胰蛋白酶液各一半）。主要步骤是消化与分装。5.动物细胞培养细胞培养的优点：一便于研究各种物理，化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响，二便于对细胞生长及发育过程的观察细胞培养必须满足两个条件：一是供给细胞存活所必须的条件，二是严格控制无菌条件。6.ABO血型 用已知的IgM类特异抗体（标准血清）与被检红细胞在室温条件下、盐水介质中反应，根据红细胞是否出现凝集现象来测定被检红细胞膜上有无与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检者的血型。大部分为RH阳性。正定型（标准血清+被检者红细胞）被检者血型反定型（标准红细胞+被检者血清）抗A抗BA型红细胞B型红细胞O型红细胞ABABO7.细胞融合原理 掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法。聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。影响融合率的因素1.温度2.PEG分子量3.细胞融合时PEG浓度。4.PEG作用时间5.所要进行融合细胞种类。10.线粒体和液泡的染色 碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料胶粒表面带阴离子，而被染得部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样他们彼此之间就能发生吸引作用，一般以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在脂类的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要