第六章 发酵染菌.ppt

第六章发酵染菌及防治 发酵过程中除了生产菌以外 还有其它菌生长繁殖 如果这些杂菌的生长失控 就会造成发酵染菌 几乎所有的发酵工业 都有可能遭受杂菌的污染 染菌的结果 轻者影响产量或产品质量 重者可能导致倒罐 甚至停产 第一节发酵过程中的染菌分析第二节发酵染菌的预防措施第三节发酵染菌后的处理第四节预防噬菌体的危害 种子培养异常主要表现有菌体生长缓慢 菌丝结团 菌体老化以及培养液的理化参数变化 发酵异常主要表现在菌体生长速度缓慢 形态不粗壮或过早老化 以及糖 氮 pH 泡沫 发酵产物 发酵浓度等理化参数不正常 一 发酵过程染菌的异常现象 二 染菌对发酵的影响 一 染菌对发酵过程本身的影响 生产不同的品种 可污染不同种类和性质的微生物 放线菌由于生长的最适pH为7左右 因此染细菌为多 而霉菌生长pH为5左右 因此染酵母菌为多 不同污染时间 不同污染途径 污染不同菌量 不同培养基和培养条件又可产生不同后果 1 发酵染菌对不同产品的影响 青霉素发酵染菌 绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶 而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶 不论在发酵前期 中期或后期 染有能产生青霉素酶的杂菌 都能使青霉素迅速破坏 链霉素 四环素 红霉素 卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得 但也会造成不同程度的危害 如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢 改变pH 降低产量 灰黄霉素 制霉菌素 克念菌素等抗生素抑制霉菌 对细菌几乎没有抑制和杀灭作用 对疫苗生产危害很大 现在疫苗多采用深层培养 这是一类不加提纯而直接使用的产品 在其深层培养过程中 一旦污染杂菌 不论死菌 活菌或内外毒素 都应全部废弃 因此 发酵罐容积越大 污染杂菌后的损失也越大 不同产品 2 污染不同种类和性质的微生物的影响 1 污染噬菌体噬菌体的感染力很强 传播蔓延迅速 也较防治 故危害极大 污染噬菌体后 可使发酵产量大幅度下降 严重的造成断种 被迫停产 2 污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫 即使添加消泡剂也无法控制逃液 影响发酵过程的通气搅拌 有的杂菌会使发酵液发臭 发酸 致使pH下降 使不耐酸的产品破坏 特别是染芽孢杆菌 由于芽孢耐热 不易杀死 往往一次染菌后会反复染菌 青霉素发酵 污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵 污染细短杆菌 假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵 污染双球菌 芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大 柠檬酸发酵 污染青霉菌肌苷 肌苷酸发酵 污染芽孢杆菌谷氨酸发酵 污染噬菌体高温淀粉酶发酵 污染芽孢杆菌和噬菌体 举例 其他杂菌污染的影响 3 不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间 不是杂菌窜入培养液的时间 杂菌进入培养液后 需有足够的生长 繁殖的时间才能显现出来 显现的时间又与污染菌量有关 污染的菌量多 显现染菌所需的时间就短 污染菌量少 显现染菌的时间就长 1 种子培养期染菌由于接种量较小 生产菌生长一开始不占优势 而且培养液中几乎没有抗生素 产物 或只有很少抗生素 产物 因而它防御杂菌能力低 容易污染杂菌 如在此阶段染菌 应将培养液全部废弃 2 发酵前期染菌 发酵前期最易染菌 且危害最大 原因发酵前期菌量不很多 与杂菌没有竞争优势 且还未合成产物 抗生素 或产生很少 抵御杂菌能力弱 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生 染菌措施可以用降低培养温度 调整补料量 用酸碱调pH值 缩短培养周期等措施予以补救 如果前期染菌 且培养基养料消耗不多 可以重新灭菌 补加一些营养 重新接种再用 3 发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢 杂菌大量产酸 培养液pH下降 糖 氮消耗快 发酵液发粘 菌丝自溶 产物分泌减少或停止 有时甚至会使已产生的产物分解 有时也会使发酵液发臭 产生大量泡沫 措施降温培养 减少补料 密切注意代谢变化情况 如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐 或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐 抑制杂菌 4 发酵后期染菌 发酵后期发酵液内已积累大量的产物 特别是抗生素 对杂菌有一定的抑制或杀灭能力 因此如果染菌不多 对生产影响不大 如果染菌严重 又破坏性较大 可以提前放罐 二 发酵染菌对提炼和产品质量的影响 1 发酵染菌对过滤的影响 1 对过滤的影响 菌体大多自溶 由于发酵不彻底 基质的残留浓度增加 发酵液的粘度加大 2 造成的后果 过滤时间拉长 影响设备的周转使用 破坏生产平衡 大幅度降低过滤收率 污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异 2 发酵染菌对提炼的影响 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质 采用有机溶剂萃取的提炼工艺 则极易发生乳化 很难使水相和溶剂相分离 影响进一步提纯 采用直接用离子交换树脂的提取工艺 会影响进一步提纯 3 发酵染菌对产品质量的影响1 染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质 对产品的纯度有较大影响 2 一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液 放置后会出现混浊 影响产品的外观 三 染菌的原因 一 发酵染菌率计算基准总染菌率指一年发酵染菌的批 次 数与总投料批 次 数之比的百分率 设备染菌率 统计发酵罐或其他设备的染菌率 不同品种发酵的染菌率 统计不同品种发酵的染菌率 有助于查找不同品种发酵染菌的原因 1 国外一抗生素发酵染菌原因的分析 二 染菌原因 2 国内一制药厂发酵染菌原因的分析 3 上海第三制药厂染菌原因分析 管理不善而染菌的有31个罐批 占25 08 经分析有下表所列原因 造成染菌的主要原因总结 1 设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔 盘管穿孔 接种管穿孔 阀门渗漏 搅拌轴渗漏 罐盖漏和其它设备漏等 从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现 这类染菌占33 85 上海三厂的分析这类染菌为37 5 所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查 对制服染菌是极其主要的 也是重要的 2 空气带菌 从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19 96 和26 国内外空气除菌技术虽已有较大改善 但仍然没有使染菌率降低到理想的程度 因为空气除菌系统较为复杂 环节多 偶遇不慎便会导致空气除菌失败 3 种子带菌 种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌 加强种子管理 严格无菌操作 种子本身带菌是可以克服的 种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成 4 灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系蒸汽通入培养基 升温快慢 保温时间 产生过多泡沫蒸汽总压是否达到要求标准环境中的杂菌数量因季节而有很大差别 原材料储存和保管 如液胨 玉米浆 母液糖等有机原料 杂菌的数量发酵罐 培养基配制罐等设备的清洗质量 有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的 5 技术管理不善 技术管理就是要对发酵每个环节严格控制 发酵中稍有不慎就可能染菌 所以不能有侥幸心理而放松管理 四 无菌状况的检测 1 环境无菌的检查尘埃粒子检测无菌平板检测 显微镜检查 染色镜检 平板划线检查 到平板空培养待测样品划线培养观察 酚红肉汤培养检查 无菌肉汤培养基空培养接入样品培养观察 2 种子及发酵液无菌状况检测 溶解氧pH值尾气中CO2含量 其他 谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化 3 判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据无菌试验的目的 1 监测培养基 发酵罐及附属设备灭菌是否彻底2 监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入3 了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角 发酵过程的杂菌检查 五 染菌情况分析 染菌的原因有多种 对于实际情况如何分析呢 1 单罐染菌和多罐染菌若是单罐染菌 即不是系统问题 而是该罐本身的问题 如种子带菌 培养基灭菌不彻底 罐有渗漏 分过滤器失效 若是多罐染菌 则一般为系统问题 如空气过滤系统有问题 特别是总过滤器长期没有检查 可能受潮失效 移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底 2 从染菌的时间来分析发酵早期染菌 种子带菌 培养基和设备灭菌不彻底 设备或管道有死角 中 后期染菌 中间补料 设备渗漏 操作不合理 3 从染菌的类型来分析耐热性芽孢杆菌 死角或灭菌不彻底 球菌 酵母 可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的 浅绿色菌落 革兰氏阴性杆菌 发酵罐的冷却管或夹套渗漏霉菌 灭菌不彻底或无菌操作不严格 第六章发酵染菌及防治 第一节发酵过程中的染菌分析第二节发酵染菌的预防措施第三节发酵染菌后的处理第四节预防噬菌体的危害 1 菌种保藏和活化 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制 沙土制备时要多次间歇灭菌注意接种时的无菌操作子瓶 母瓶的移种和培养无菌室和摇床间都要保持清洁 无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气 还要装紫外灯用以灭菌 或用化学药品灭菌 一 防止种子带菌 2 种子培养基灭菌的注意事项 灭菌操作时需要注意排气管是否畅通固体培养基可采用两次灭菌的方法通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121 C所需的时间与瓶内培养基的体积有关 3 种子摇瓶培养的注意事项保证摇瓶间的清洁卫生摇瓶内液体装料不宜过多瓶口包扎的纱布一般为八层以上 无菌室要求 无菌室操作要点 无菌室装有紫外灯 打开紫外灯 照半小时 关灯后15分钟再接种 用消毒药水如新洁而灭配成1 1000浓度擦桌子 拖地 开启超净台的通风 接种时必须在超净台上操作 超净台装有一台鼓风机 进风口有一粗过滤器 出风口有高效过滤器 无菌操作时 接种人员必须穿无菌服 戴口罩 手用酒精棉球擦干净 无菌室内无菌度的要求 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟 根据一般工厂的经验 长出的菌落在3个以下为好 无菌室立体示意图 高效空气粒子过滤气体走向 二 防止设备渗漏 设备和管件的渗漏指设备和管件由于腐蚀 内应力或其他原因形成微小漏孔发生渗漏现象 这些漏孔很小 特别是不锈钢材料形成的漏孔更小 有时肉眼不能直接觉察 需要通过一定的试漏方法才能发现 设备上一旦渗漏 就会造成染菌 例如冷却盘管 夹套穿孔渗漏 有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌 阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌 1 设备渗漏的原因 发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀 磨蚀发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起管外壁磨损冷却介质和加热时蒸汽的冲击 引起管内壁的磨损 设备加工不良弯管时 弯头处管壁变薄焊接不良 发酵罐内冷却管的安装 2 盘管渗漏的防止放罐后认真清洗发酵罐控制冷却水质量 降低其中氯离子含量对盘管定期检查 试漏 及时发现漏隙空气分布管渗漏的防止试漏方法气压试验 先在发酵罐内放满清水 用压缩空气通入管子 观察水面有无气泡产生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位 水压试验 用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管 泵到一定压力时 观察管子有否渗漏现象 3 罐体渗漏的防止4 管件的渗漏阀门与管件 与发酵罐相连接的管路很多 有空气 蒸汽 水 物料 排气 排污等管路 管路多 相应的管件和阀门也多 管道的连接方式 按装方法以及选用的阀门形式对防止污染有很大的关系 所以 与发酵有关的管路不能同一般化工厂的化工管路完全一样 而有其特殊的要求 由宁法兰 阀门试漏的方法 管路的连接管子的连接有螺纹连接 法兰连接和焊接三种 螺纹连接 螺纹连接需在管端铰出管螺纹 安装时在螺纹上涂以白漆并加麻丝 也有用聚四氟乙烯薄膜 生料带 作为填料 如密封要求高的可用石墨粉加少许机油作为填料 或用氧化铅甘油胶合剂更好 螺纹连接简单 但装拆较麻烦 为了便于装拆 要在管路上适当位置安装活接头 亦称 由宁 接头平面用石棉橡胶板或橡皮等作垫圈 由于管路受冷热和震动的影响 活接头的接口易松动 使密封面不能严密而造成渗漏 所以 重要的管路连接大多采用法兰连接 法兰连接 法兰连接密封可靠 压力 温度和管径的适用范围大 但费用较高 焊接 焊接的方法比其他方法简便 而且密封可靠 所以空气灭菌系统 培养液灭菌系统和其他物料管路以焊接连接为好 但需经常拆卸的管路则不宜用焊接连接 管路 管件的试漏一般在管路中通入压缩空气并在焊缝和连接处涂以肥皂水 如有肥皂泡发生 则表示此处有泄漏 需重新焊接或安装 培养基灭菌方法 高压蒸汽灭菌分批灭菌121 30分钟连续灭菌罐温125 130 30 45分钟 三 防止培养基灭菌不彻底 实消中蒸汽下进上出 连续灭菌设备流程 连消塔 维持罐 喷射加热器 薄板换热器 培养基灭菌前含有大量杂菌 灭菌时如果蒸汽压力不足 达不到要求的温度 灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积 就会窝藏大量杂菌 造成灭菌不彻底 为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢 培养基和水的传热系数比空气的传热系数大 如果灭菌时升温太快 培养基急剧膨胀 发酵罐内的空气排出较慢 就会产生大量泡沫 泡沫上升到发酵罐顶 泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接接触 未被杀死 防止方法 缓慢开启蒸汽阀门 或加入少量消泡剂 灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些 死角 这些死角蒸汽不能有效达到 常会窝藏耐热芽孢杆菌 所以设备安装要注意不能造成死角 发酵设备要经常清洗 铲除污垢 由于罐体和有关管路均需用蒸汽进行灭菌 对于某些蒸汽可能达不到的死角 如阀 要装设与大气相通的旁路 图中的小阀门 在灭菌操作时 将旁路阀门打开 使蒸汽自由通过 接种 取样和加油等管路要配置单独的灭菌系统 使能在发酵罐灭菌后或在发酵过程中单独进行灭菌 例 接种管路的死角 种子罐利用压力差将其中培养好的种子输入发酵罐 其中连接管路的灭菌是与发酵罐同时进行 不合理补料管配置造成的死角 压力表安装不合理形成的死角 排气管的死角罐顶排气管弯头处如有堆积物 其中窝藏的杂菌不容易彻底消灭 而当发酵时受搅拌的震动和排气的冲击就会一点点地剥落下来造成污染 另外排气管的直径太大 灭菌时蒸汽流速小也会使管中部分耐热菌不能全部杀死 所以排气管要与罐的尺寸有一定比例 不宜过大或过小 不锈钢衬里的死角某些有机酸的发酵对碳素钢有腐蚀时 小型发酵罐通常采用不锈钢制造 对于大型发酵罐 为了节约不锈钢材料起见 一般都采用不锈钢衬里的方法 即在碳钢制造的壳体内加衬一层薄的不锈钢板 厚约1 3毫米 如果不锈钢衬里加工焊接不善 在钢板和焊缝处有裂缝 或在操作时不注意 使不锈钢皮鼓起后产生裂缝 发酵液就会通过裂缝进入衬里和钢板之间 窝藏在里面形成死角 四 防止空气引起的染菌 空气过滤除菌设备流程 空压机 储罐 二级冷却 加热器 空气过滤 粗过滤 空气冷却器的列管穿孔泄露 冷却水会渗入到空气中 造成染菌 棉花 活性炭过滤器长期使用后 棉花和活性炭的体积被压缩而松动 如果上下端棉花铺得厚薄不均 厚的一边阻力大空气不畅通 薄的一边空气容易通过 久而久之 薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置 造成过滤器失效 过滤器用蒸汽灭菌时 若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能 灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气 将水分吹干 超细纤维纸作过滤介质 灭菌时必须将管道中冷凝水放干净 以免介质受潮失效 在生产实践中 空气管道大多与其它物料管道相接 要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器 导致过滤介质失效 五 防止操作不当引起的染菌 为防止染菌 有关人员要严格按规程操作 特别是补料 取样 接种等 对罐压力的降低 泡沫顶盖 发酵液倒流过滤器等情况应严格操作与管理 第六章发酵染菌及防治 第一节发酵过程中的染菌分析第二节发酵染菌的预防措施第三节发酵染菌后的处理第四节预防噬菌体的危害 1 发现染菌后的挽救措施 为了减少损失 对被污染的发酵液要根据具体情况采取不同的挽救措施 如果种子培养或种子罐中发现污染 则这批种子就不能再继续扩大培养 因为此时的损失毕竟是很小的 发酵早期染菌可以适当添加营养物质 重新灭菌后再接种发酵 中后期染菌 如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时 应该提早放罐 在染菌的发酵液内添加抑菌剂 如小剂量的抗菌素或醛类 用以抑制杂菌的生长也是一种办法 抑菌剂要事先经过试验 确实证明不妨碍生产菌的生长和发酵才能使用 因而不是所有发酵都能使用抑菌剂 另外 采用加大接种量的办法 使生产菌的生长占绝对优势排挤和压倒杂茵的繁殖 也是一个有效的措施 还有将种子罐中种子培养好后 进行冷冻保压 1 5公斤 厘米2 10 左右 经平板检查证明无杂菌后 再接入发酵罐发酵 这一措施在一些谷氨酸发酵生产工厂取得很好效果 2 有时发酵罐偶而染菌 原因一时又找不出 一般可以采取以下措施 1 连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份 杂菌较旺盛生长的时间 加入0 2 甲醛 加热至80 存放处理4小时 以减少带入培养液中的杂菌数 2 对染菌的罐 在培养液灭菌前先加甲醛进行空消处理 甲醛用量每立方米罐的体积0 12 0 17升 3 对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌 灭菌后水量占罐体的三分之二以上 这是因为细菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故 3 发酵染菌后的措施 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道 灭菌方法 可通蒸汽灭菌 也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时 才放下水道 否则由于各罐的管道相通 会造成其它罐的染菌 而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌 凡染菌的罐要找染菌的原因 对症下药 该罐也要彻底清洗 进行空罐消毒 才可进罐 染菌厉害时 车间环境要用石灰消毒 空气用甲醛熏蒸 特别 若染噬菌体 空气必须用甲醛蒸汽消毒 第六章发酵染菌及防治 第一节发酵过程中的染菌分析第二节发酵染菌的预防措施第三节发酵染菌后的处理第四节预防噬菌体的危害 一 染噬菌体的防治 一 染噬菌体对发酵的影响 发酵过程中如果受噬菌体的侵染 一般发生溶菌 随之出现发酵迟缓或停止 而且受噬菌体感染后 往往会反复连续感染 使生产无法进行 甚至使种子全部丧失 噬菌体是一种病毒 可通过环境污染 设备的渗漏或死角 空气系统 培养基灭菌不彻底 补料过程及操作失误 菌种带进噬菌体或本身是病源性菌株等途径而染菌 二 产生噬菌体的原因 通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害 经过1 2年以后 主要是由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去 自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长 造成了自然界中噬菌体增殖的好机会 这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播 以及人们的走动 车辆的往来也携带着噬菌体到处传播 使噬菌体有可能潜入生产的各个环节 尤其是通过空气系统进入种子室 种子罐 发酵罐 三 染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基 加琼脂 作下层 同样的培养基中加入20 30 培养好的种子液 再加入怀疑染噬菌体的发酵液 摇均匀后 铺上层 培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑 也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液 而将发酵液直接点种在上层培养基表面 培养过夜 观察有无透明圈出现 四 噬菌体的防治 1 必须建立工厂环境清洁卫生制度 定期检查 定期清扫 车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉 2 车间地面和通往车间的道路尽