(赵建乐)牛抗菌肽及其基因工程研究进展.doc

牛抗菌肽及其基因工程研究进展赵建乐收稿日期: ; 修回日期: 基金资助：西北农林科技大学引进人才启动专项基金（01140408）资助项目；2009西北农林科技大学基本科研业务费青年项目（109021003）；2009国家级动物科学实验教学示范中心建设项目；2009西北农林科技大学校级重点大学生创新性实验计划资助项目作者简介: 赵建乐(1986-)，男（汉），河北邢台人，硕士生。*通讯作者，教授，从事药理学研究与新药研发，TelE-mail：，李引乾1，陈琛2，闫茂仓3，田泽华1，张晶艳1，张小莺1*（1. 西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100；2. 陕西理工学院 陕西省生物资源重点实验室，陕西汉中 723000；3. 浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州 325005）摘要：综述了牛抗菌肽（ABP）的类别、组织分布、生物活性、基因结构等方面的研究进展，对采用基因工程技术表达牛ABP的方法进行了评述，并展望了其转基因技术的应用前景，提出利用生物信息学构建牛ABP肽库的新思路。关键词：牛；抗菌肽；基因工程Advances in bovine antibacterial peptides and their genetic engineeringZHAO Jian-le1, LI Yin-qian1, CHEN Chen2, YAN Mao-cang3, TIAN Ze-hua1, ZHANG Jing-yan1, ZHANG Xiao-ying1*(1.College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;2. College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;3. Zhejiang Mariculture Research Institute, Wenzhou 325005, China)Abstract: Advances in classification, tissue distribution, bioactivity and genetic structures of bovine antibacterial peptides (ABP) were reviewed. The approachs to express bovine ABP via genetic engineering, and the application outlook of the their transgene technology were discussed. The new ideas of building bovine ABP library via bioinformatics were proposed.Key words: cattle; antibacterial peptides; genetic engineering抗菌肽（Antibacterial peptides，ABP）是生物长期进化过程中保留的天然免疫中的重要活性分子。它分布广泛, 现已从哺乳动物、昆虫、两栖动物、植物、真菌、细菌等中发现了上千种ABP1。ABP抗菌谱广，可直接杀灭多种病原微生物，还可通过调节免疫系统激发一系列与炎症、免疫有关的生物效应，有些ABP还有抗肿瘤等作用2。有关ABP特性与机理的综述已有不少，此不赘述。本文专注于牛源ABP的研究进展。牛体内发现的ABP普遍理化性质稳定，对多种病原菌有抑杀作用，已成为众多表达系统外源导入基因的重要候选物。1 牛ABP的分类及特点1991年Diamond从牛气管黏膜分离得到第一个牛ABP，至今已发现至少38种牛ABP，包括阳离子性的防御素（Defensins）和Cathelicidins、阴离子ABP及牛乳铁素。1.1 防御素防御素是一类富含精氨酸和3个二硫键的阳离子ABP，根据半胱氨酸的位置和连接方式分为、和防御素。目前在牛体内只发现了防御素，包括气管抗菌肽（Tracheal antimicrobial peptide，TAP）、舌抗菌肽（Lingual antimicrobial peptide，LAP）、牛中性粒细胞防御素（Bovine neutrophil -defensins，BNBDs）、小肠防御素（Enteric -defensin，EBD）等。1.1.1 牛防御素的基因结构及一级结构 大多数已知的牛防御素基因位于27号染色体的同一段序列上，均由2个外显子和1个内含子构成 3。TAP基因的两个外显子被一个1.5 kb的内含子所分割，第1个外显子编码信号肽，第2个外显子编码前序列和成熟肽4。LAP、BNBD、EBD的基因长度与TAP的相似，内含子都为1.5 kb左右。而bBD-1的内含子则大得多，约8.5 kb 5。牛防御素由约40个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸分别以1-5，2-4，3-6相连，形成3 对分子内二硫键2(图1)。牛防御素富含精氨酸，且其一级结构某些位置的氨基酸残基具有高度保守性(图1)。TAPNPVSCVRNKGICVPIRCPGSMKQIGTCVGRAVKCCRKKLAPQGVRNSQSCRRNKGICVPIRCPGSMRQIGTCLGAQVKCCRRKEBDGISNPLSCRLNRGICVPIRCPGNLRQIGTCFTPSVKCCRWRBNBD1DFASCHTNGGICLPNRCPGHMIQIGICFRPRVKCCRSWBNBD2VRNHVTCRINRGFCVPIRCPGRTRQIGTCFGPRIKCCRSWBNBD3pEGVRNHVTCRINRGFCVPIRCPGRTRQIGTCFGPRIKCCRSWBNBD4pERVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRBNBD5pEVVRNPQSCRWNMGVCIPISCPGNMRQIGTCFGPRVPCCRRWBNBD6pEGVRNHVTCRIYGGFCVPIRCPGRTRQIGTCFGRPVKCCRRWBNBD7pEGVRNFVTCRINRGGFCVPIRCPGHRPQIGTCLGPRIKCCRBNBD8VRNFVTCRINRGFCVPIRCPGHRRQIGTCLGPQIKCCBNBD9pEGVRNFVTCRINRGFCVPIRCPGHRRQIGTCLGPQIKCCRBNBD10pEGVRSYLSCWGNRGICLLNRCPGRMRQIGTCLAPRVKCCRBNBD11GPLSCRRNGGVCIPIRCPGPMRQIGTCFGRPVKCCRSWBNBD12GPLSCGRNGGVCIPIRCPVPMRQIGTCFGRPVKCCRSWBNBD13SGISGPLSCGRNGGVCIPIRCPVPMRQIGTCFGRPVKCCRSWbBD-1ALGQRSDSYICARKGGTCNLSPCPLYNRIEGTCYRGKAKCCIR123456图1 牛防御素的一级结构Fig. 1 Primary sequences of bovine -defensins恒定和高度保守的氨基酸以灰色表示；阳离子氨基酸（组氨酸、赖氨酸、精氨酸）用粗体表示；6个半胱氨酸分别以1-5，2-4，3-6相连，形成3对分子内二硫键。The invariant and highly conserved residues are shown as gray, and positively charged residues(H, K, and R) are bolded. Three disulfide pairings are formed by six cysteines with 1-5, 2-4, 3-6 connection.1.1.2 牛防御素的组织分布及活性 牛防御素主要分布在与外界环境接触较多的上皮组织和血细胞中（表1）。表1 牛防御素总结Tab. 1 Summary of bovine -defensins名称(参考文献)Name(References)组织分布Tissuedistribution可诱导性Inducibility调节因子Regulatory factorsTAP6气管、肺泡巨噬细胞Trachea, alveolar macrophages诱导型InducibleNF-BNF IL-6LAP7消化道、呼吸道、乳腺上皮、结膜Digestive tract, respiratory tract, breast epithelium, conjunctiva诱导型InducibleNF-BNF IL-6EBD8小肠Intestine诱导型InducibleNF IL-6BNBD 49中性粒细胞、气管、肺泡巨噬细胞、结肠、远端小肠、肺、脾Neutrophils, trachea, alveolar macrophages, colon, distal small intestine, lung, spleen组成型ConstitutiveBNBD 59中性粒细胞、气管、肺泡巨噬细胞Neutrophils, trachea, alveolar macrophages组成型ConstitutiveBNBD 12, 139中性粒细胞、气管、结肠、远端小肠Neutrophils, trachea, colon, distal small intestine组成型ConstitutiveBNBD 13, 6119中性粒细胞Neutrophil组成型ConstitutivebBD-14乳头黏膜、肾脏、阴道、卵巢、输卵管、结肠Nipple mucosa, kidney, vagina, ovaries, fallopian tubes, colon组成型ConstitutiveDEFB4013乳腺Mammary gland诱导型InducibleTAP从牛的气管上皮分离得到10。TAP前原肽（Prepro-peptide）有64个氨基酸，包含20个氨基酸的信号肽和一个短的前序列(FTQGVG)。TAP可被多种病原体和促炎因子（TNF-a、IL-1b和LTA）诱导。脂多糖可增加TAP的表达量。TAP对金葡菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和白色念珠菌（Candida albicans）的最小抑菌浓度（MIC）分别为25、12、25、12和6 g/ml。从牛舌上皮分离的LAP含42个残基，其前原肽由64个氨基酸组成，包含20个氨基酸的信号肽和2个残基的前序列(phe-thr)。LAP在消化道、呼吸道、乳腺上皮和结膜均有表达11。在溶血性巴氏杆菌（Pasteurella hemolytica）引起的急性感染和副结核慢性感染中均可观察到LAP表达12。患乳房炎时，LAP的表达量增加，表明LAP有抗乳房炎的作用11。LAP对S. aureus、E. coli、P. aeruginosa和C. albicans的MIC值分别为63、16、63和3 g/ml13。Selsted等9从牛中性粒细胞中分离到13种BNBDs。BNBDs包含38-42个残基，5 kD左右，高度阳离子性。有些BNBDs还表达于气管、肺、肾、小肠中（表1）。大多数BNBDs 对E. coli ML-35和S. aureus 502A的MIC值约为10 g/ml。EBD在牛的小肠末端和结肠中高水平表达8。在肠内隐孢子虫（Cryptozoite）的诱导下，肠道中EBD mRNA的表达量升高5-10倍，表明EBD在抗寄生虫感染中发挥作用8 。Roosen等3用PCR技术，以牛防御素基因的保守序列为引物，从牛细菌人工染色体文库中筛选出6个新的防御素基因：DEFB401、DEFB402、DEFB403、DEFB404、DEFB405和LAP-like。DEFB401表达于放线菌感染的组织，为诱导型表达。LAP-like与LAP的前原肽仅有一个氨基酸差异，由前原肽第18位的甘氨酸换成了丙氨酸。Aono等4利用表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）比对分析，在牛体内发现了一种分子结构和生物活性与人防御素-1 (hBD-1)相似的防御素：bBD-1。它在乳头黏膜、肾脏、阴道、卵巢、输卵管、结肠均有表达。合成的bBD-1对盐敏感，在低盐浓度时对引起乳腺炎的E.coli临床分离株有抑制作用，但对Staphylococcus临床分离株的抑制作用较弱。最新的牛基因组序列已于2009年公布，利用已知的牛或其它相近物种的防御素基因序列建模，将其与牛基因组序列比对分析，有望发现更多的牛防御素基因。Cormican等14利用牛基因组序列搜索含有防御素特征性的6个半胱氨酸基序的基因，发现了57个开放阅读框（ORF），这些新基因将进一步丰富牛防御素家族。1.2 CathelicidinsCathelicidins是一类存在于多种哺乳动物中，在C端结构上存在很大差异的ABP，因其分子中都含有与Cathelin（一种从猪白细胞中分离出的组织蛋白酶L抑制剂）相似的结构而得名15。1.2.1 基因结构及其编码肽 Cathelicidins基因包括4个外显子和3个内含子，前3个外显子用于编码前导序列，第4个外显子编码抗菌域序列16。Cathelicidins通过基因编码的前原肽生成。前原肽包括前导序列和抗菌域序列。当前导序列脱离后，成熟的Cathelicidins便可分泌出来15。前导序列的同源性高，其又可以分为信号肽序列和类Cathelin序列。抗菌域序列与其抗菌活性相关，也是Cathelicidins命名的依据。1.2.2 种类与活性 已发现8种牛Cathelicidins。按其C端结构可分为-螺旋结构、伸展螺旋结构和环状结构（表2）。表 2 牛Cathelicidins及氨基酸序列Tab. 2 List of bovine cathelicidins and their amino acid sequences名称（参考文献）Name(References)氨基酸序列和数目Amino acid sequences and number-螺旋-helicalBMAP-271）17GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHLG (27)BMAP-281）17GGLRSLGRKILRAWKKYGPIIVPIIRIG (28)BMAP-341）18GLFRRLRDSIRRGQQKILEKARRIGERIKDIFRG (34)伸展螺旋Extended-helicalBac4 19RRLHPQHQRFPRERPWPKPLSLPLPRPGPRPWPKPL (36)Bac51）20RFRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPPLGPFPG (43)Bac7 20RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPGPRPIPRPLPFPRPGPRPIPRPLPFPRPGPRPIPRPL (60)Indolicidin1）21ILPWKWPWWPWRR (13)环状结构Loop-structuredDodecapeptide22RLCRIVVIRVCR (12)1)表示C 端的氨基酸残基酰胺化1)indicates amidation of the amino acid residue at the C-terminus.-螺旋Cathelicidins抗菌谱较广。对临床耐药株的抑菌试验表明，BMAP-27、BMAP-28抗菌效果很强，抗真菌MIC值与抗细菌相同或略高。BMAP-27、BMAP-28对哺乳动物细胞有毒性23。BMAP-27的N端和C端分别有苯丙氨酸和亮氨酸拉链，以苯丙氨酸替换这两段序列后，其抗菌活性不变，但对哺乳动物的细胞毒性降低24。BMAP-34抗革兰阳性菌和阴性菌，但对真核细胞没有作用25。伸展螺旋Cathelicidins为线性肽，富含脯氨酸和精氨酸，包括Bac5、Bac7、Indolicidin和Bac421，前3种是从牛中性粒细胞中分离得到，Bac4并未从牛体内分离出，而是根据其基因序列，推导出氨基酸序列19。Bac5和Bac7在体外有很强的广谱抗菌活性。在浓度为0.5-20 mol/L时能杀死E. coli，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、K. pneumoniae、肠球菌（Enterococcus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。而合成的Bac4仅在低盐条件下才有抑菌活性19。Indolicidin抗菌谱广，其杀菌浓度为0.1-1 mol/L。另外，indolicidin还抗多种细菌的临床分离株（如P. aeruginosa、Candida）以及寄生虫。Indolicidin还表现出直接的剂量依赖性和时间依赖性的杀病毒活性，可以抗人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）26，抗病毒所需浓度比抗细菌和抗真菌的高。Indolicidin对人和鼠的T淋巴细胞有毒性，能溶解红细胞，静脉注射毒性较大，LD10为0.9 mg/kg。将indolicidin的脯氨酸替换为赖氨酸产生一系列类似物，其与indolicidin亲本的抑菌活性、抗炎活性、中和LPS的能力相当，但对机体没有细胞毒性，有望成为新型抗菌药物27。从牛中性粒细胞中分离得到的Dodecapeptide是已知最小的天然阳离子ABP，含12个氨基酸残基22，对E. coli和S. aureus呈强杀菌活性，对胎鼠的神经元、星形细胞以及人的胶质母细胞瘤有极强的细胞毒性。1.3 阴离子ABP阴离子ABP存在于牛支气管及细支气管的上皮细胞中。新生牛支气管肺泡洗出液中阴离子ABP的浓度是成年牛的3倍，但对溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）的杀菌活性明显弱于成年牛的28。阴离子ABP的作用机制尚不清楚，但发现锌能使其活性增加，因此推测阳离子盐桥能克服微生物表面的负电荷。1.4 乳铁素与其它由基因表达的ABP不同，牛乳铁素(Lactoferricin，LfcinB )是乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)在消化道正常生理条件下，在胃蛋白酶的作用下释放出的一种肽。其含25个氨基酸残基，对应于LF氨基端的17-41位氨基酸，其一级结构为：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。LfcinB的抑菌效果是LF的400倍，在胃肠道作用更强，耐热、在消化道中不易降解、无抗原性。LfcinB可抗多种革兰阳性和阴性菌，对耐抗生素的S. aureus和E. coli也有抑制作用29，还能抗病毒和真菌，但不作用于双歧杆菌（Bacillus bifidus）等益生菌，并能刺激细胞生长、参与免疫调节。2 牛ABP基因工程表达从牛体内分离ABP天然产物对于拓展人们对ABP的认知与构建规模化的肽库至关重要，但从ABP高效表达角度，已更多趋向于用基因工程技术实现对ABP的表达、改造和大规模生产。多种ABP的基因已被克隆和表达，其中牛的LAP、indolicidin、LfcinB等由于抗菌谱广、活性高而成为克隆表达的热门基因。2.1 表达系统2.1.1 E. coli表达系统 该系统遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短，获得ABP的产量从0.1 mg/l到300 mg/l不等30。Bera等31利用E. coli BL-21表达出融合有组氨酸标签（His Tag）的水牛BNBD4，并用镍柱纯化获得。2.1.2 酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高的特点；其表达产物可分泌至胞外，利于分离纯化。易俊波等32根据毕赤酵母的偏爱密码子人工合成LfcinB基因片段，将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中，再转化入毕赤酵母细胞SMDll68内，获得的分泌型表达产物对S. aureus有较强的抑杀作用。2.1.3 杆状病毒表达系统 杆状病毒以昆虫细胞为宿主。该系统易培养，成本低，外源基因表达产量高，具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰功能。Nakamura等33用杆状病毒-昆虫细胞体系表达了包含有LfinB的牛乳铁蛋白N-端部分(N-lobe of bovine lactoferrin，LfN)，从1 mL细胞培养液中可获得10 g LfN，产物对E. coli O111有抗菌活性。2.2 表达策略 许多因素会影响ABP的表达：ABP对宿主的抑杀作用，宿主对ABP的降解作用，牛ABP与低等微生物宿主的密码子偏爱性不一致。为了使ABP获得高效表达，应选相应的表达策略。2.2.1 人工合成ABP编码基因 早期获得ABP目的基因的方法多以来源于组织细胞的DNA或RNA为模板进行PCR扩增，此方法受取材限制，且操作步骤较繁琐。随着对基因工程要求的提高，快速合成DNA片段、定向修改、设计生物基因的方法显得十分重要。王铁东等34 根据已经发表的牛TAP cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段，以重叠延伸PCR的方法合成TAP基因，通过转基因技术，使TAP基因在山羊乳腺组织内表达，结果显示奶样对S. aureus和E. coli有明显抑制作用。2.2.2 融合表达策略 异源表达ABP面临多种困难，一是ABP所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶非常敏感，很难实现ABP的大量表达；二是由于ABP的抗菌作用会反馈性抑制宿主细胞活性，影响ABP的进一步表达。采用融合表达策略可以抵消其碱性并通过暂时改变ABP分子的构像以降低其对宿主细胞的毒性，增加产物的稳定性，避免酶降解，利用所带的分子标签通过亲和层析可纯化产物35。常用的融合蛋白有谷胱甘肽S-转移酶、包涵体形成蛋白、硫氧还蛋白。融合表达的ABP可用化学或酶切释放。酶切较昂贵，可选用溴化氰于蛋氨酸处剪切36，但溴化氰剧毒，且剪切效率不高37。羟胺剪切效率较高，且毒性低。Morin等30将串联indolicidin与硫氧还蛋白融合，表达于E. coli BL21DE3中。利用表达的His Tag先用亲和层析纯化，再用溴化氰将串联的indolicidin三肽裂解为indolicidin单体，用RP-HPLC将indolicidin单体纯化。表达的indolicidin对S. aureus、S. epidermidis和蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）的MIC值分别为2、8、4 g/ml，同化学合成的indolicidin抑菌效果相似。2.2.3 串联多肽表达策略 较大分子量的串联多肽在检测、纯化以及结构稳定性方面都优于单体肽。Tian等38据此设计了串联多肽表达策略，将LfcinB 的15个氨基酸的衍生肽LfcinB15-W4,10的基因连接成多个串联拷贝，插入表达载体pET32a，LfcinB15-W4,10低聚物在E. coli BL21中高水平表达。从1 L培养物中纯化出10 mg，纯度大于99的四聚体，四聚体同LfcinB15-W4,10单体的抑菌活性相同。2.3 表达蛋白的分离纯化一般首先采用亲和层析来纯化融合了标签蛋白（如His Tag、GST Tag）的重组ABP，再用化学和酶切方法释放融合表达的ABP。之后用高效液相色谱（HPLC）对ABP进一步纯化。Feng等39用E. coli系统表达LfcinB的衍生物LfcinB-W10，利用Glutathione Sepharose 4B亲和柱纯化带有GST Tag的目的蛋白，用肠激酶分解融合蛋白，释放出rLfcinB-W10，最后用RP-HPLC对其纯化，最终从1 L培养液中可得到300 g的rLfcinB-W10。3 牛ABP转基因应用将广谱抗菌的ABP与转基因技术结合培育抗病动植物是我国转基因重大专项研究的重要组成部分，而在转入基因的选择上，TAP、Indolicidin及其衍生物应用的较多。3.1 转ABP基因动物外源蛋白在哺乳动物乳腺中能够正确修饰和折叠，这使得利用动物乳腺作为生物反应器生产生物药用蛋白在制药工业上具有良好前景。Yarus等40将含乳清蛋白基因调控区和牛TAP cDNA连接培育转基因小鼠，在乳汁中成功表达和分离到具有抗菌活性的重组TAP。乳汁中TAP浓度为5 g/ml，可有效抑制E. coli、K. pneumoniae和C. albicans。2009年，张涌团队将人防御素3基因与奶牛酪蛋白启动子结合，得到人防御素3基因乳腺特异性高效表达载体pEBB，将其转染牛乳腺细胞后，表达的重组人防御素3对Staphylococcus、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、E. coli等有显著抑菌活性。将此载体导入高产奶牛的皮肤成纤维细胞中，经过体外培养及筛选，用体细胞克隆方法得到了世界首例转人防御素基因克隆奶牛，经PCR、Southern blot等方法检测，8头健康存活的克隆牛均整合有人防御素3基因结构（私人通讯，未发表）。笔者认为，转基因克隆牛的降生标志着ABP研究的重大转变，即：以从生物体内获得ABP的多肽研究为主转变为兼及对已有ABP资源的开发利用和在体移植表达。3.2 转牛ABP基因植物Feuvre等饲喂蚜虫indolicidin，杀死其体内共生菌，从而达到杀灭蚜虫的目的。组织学分析表明，饲喂过indolicidin的蚜虫体内的共生菌明显减少，Indolicidin对蚜虫的致死率呈明显的剂量依赖关系。此结果提示可培育转indolicidin基因的抗虫农作物41。Rev4是与indolicidin氨基酸序列相反的ABP，体外实验表明Rev4有很强的抗菌活性，并可抗酶解。Xing等42培育转Rev4基因烟草。转基因烟草能够抵抗3种细菌和2种卵菌的感染，并且比对照组的产量提高34%。4 展望牛ABP的发现在早期主要是从大量的组织样本中分离、纯化，通过抑菌活性追踪ABP，此法存在很大的盲目性，费时费力。牛ABP已发现不少，笔者认为，目前牛基因组序列以及牛EST信息已较为全面，运用生物信息学技术进行序列比对可实现高通量筛选牛ABP基因。对于生物活性较强的ABP可进一步利用生物信息学方法比较其氨基酸序列异同，有望通过发现影响其活性的基本序列（母核），构建ABP肽库，并以此为基础筛选高活性的ABP，以及对天然ABP进行药物化改造。牛ABP是很好的外源导入型抗菌基因来源，牛ABP转基因动植物的成功培育为解决农作物病虫害以及动物传染病提供了新思路，成为一种很有希望的抗生素替代手段。参考文献(References)1 SEEBAH S, SURESH A, ZHUO Shao-wei, et al. 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