细胞培养技术.ppt

细胞培养技术 基本知识基本技术污染与监测 一 细胞培养的基本知识 一 概念 由组织分散成单个细胞进行体外培养的方法 即模拟体内的生理环境条件 提供细胞适宜的营养条件和温度 在无菌操作的基础上 使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 细胞培养技术在遗传学 免疫学 肿瘤学 病毒学 分子生物学等领域已得到广泛的应用 二 培养细胞的特性 贴壁型接触性抑制和密度抑制贴附于支持物表面 生长中形成汇片 大多数细胞属此型 失去在体内特有形态 成纤维细胞型 上皮细胞型 其他悬浮型悬浮生长 单个分散或成团 各种源自血液的细胞 骨髓 脾细胞 1 培养细胞的生长方式及特点 成纤维细胞来源于中胚层间充质组织起源的组织 如 纤维结缔组织 心肌 平滑肌 血管内皮等形态为梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2 3个长短不等的突起 中有卵圆形核 一般不紧靠成片 呈漩涡状 放射状排列 上皮样细胞来源于外胚层及内胚层细胞 如 皮肤 乳腺 肝 肺泡 消化道等形态为扁平 不规则多角形 中有圆形核 具连接成片的能力 2 培养细胞的生长过程 单个细胞的生长过程 细胞周期 即细胞分裂形成2个子代细胞的过程 分为间期 G1 S G2期 和分裂期 M期 2个阶段 群体中多数细胞处于间期 少数处于分裂期 间期持续时间较长 分裂期较短 每一代细胞的生长过程 传代 养容器中细胞增殖至一定密度后 分离出一部分细胞至新的培养容器 接种 并更新营养液的过程 一代 胞接种后到下一次再传代的一段时间 每代细胞生长过程的三个阶段 潜伏期 生长缓慢指数生长期 对数期 增殖旺盛 活力最佳适用于实验研究平台期 生长停止期 及时传代 培养细胞的生命期 定义 细胞在培养中持续增殖和生长的时间 一般可分为原代培养期 传代期和衰退期 原代培养 从体内取出细胞接种后到第一次传代 一般维持1 4周 传代期 原代细胞一经传代即成为细胞系 进入传代期 此期在全生命期中持续时间最长 一般传10 50代 随后细胞增殖缓慢以至完全停止 细胞进入衰退期 Hayflick极限的概念 衰退期 细胞增殖缓慢以至完全停止 细胞死亡 肿瘤细胞 无限细胞系 永久增殖 Hayflick极限 体外培养的细胞增殖能力不是无限的 传代次数有一定的界限 称为 Hayflick极限 传代次数与物种寿命有关 小鼠寿命3年 传代12次 龟寿命200年 传代140次 传代次数与个体年龄成反比 人胚胎 40 60代 幼年 20 40代 成年 10 30代 早老病儿童 2 10代 三 细胞培养的基本条件 营养物质培养基 血清温度湿度35 37 饱和湿度气体95 空气 5 CO2酸碱度pH7 2 7 4 酚红指示 渗透压260 320mmol L无污染及无毒 酸性 黄色中性 桃红色碱性 紫红色 MEM 最低必需培养液 是由Eagle s基础培养基发展而来 其中增加了组分的范围及浓度 DMEM Dulbecco改良的MEM 是为小鼠成纤维细胞设计的 现在常用于贴壁细胞的培养 又分低糖型 葡萄糖1000mg L 和高糖型 葡萄糖4500mg L 高糖型适用于生长快 附着性差的细胞 Ham sF12 是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的 现在广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养 F12还可与DMEM等体积混合使用 即DMEM F12 应用于原代培养及更难养的细胞系的培养 RPMI1640 是为淋巴细胞培养而设计的 最初适合悬浮细胞的培养 现在广泛用于癌细胞和正常细胞的培养 培养基 血清 血清含有生长因子可促进细胞的繁殖 含有附着因子可促进细胞的贴壁 同时还具有抗胰酶活性 血清同时也是矿物质 脂类及激素的来源 常用血清 小牛血清 新生牛血清 胎牛血清和马血清等 牛血清是按照采血时间的早晚来分类的 采血时间越早 营养物质越丰富 所含抗体也越少 因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养 血清批次间的差别就是不可避免的 其差异来源于不同的制备方法和除菌方法 动物的年龄差别及血清的储存条件等 而且与取血动物的来源关系密切 不同的牧场 不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量 因此选好了一种血清就要尽可能长期使用它 无血清培养基 Serum FreeMedia 就是在细胞培养中不添加血清 但可添加血清的主要成分 粘附因子 生长因子 必需的营养物质和激素等 能减少血清对某些要求高的基础性研究的不利影响 但去除血清的同时 也去除了一些血清蛋白具有的保护 解毒作用 因此对试剂 水的纯度和仪器清洁度的要求更高 生长培养液维持培养液基本培养液80 90 95 98 血清10 20 2 5 培养用液使用注意事项 大部分添加物和试剂最多可以冻融3次 如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀 影响性能 在新鲜培养基中一旦添加了血清和抗生素 应在两到三周内使用 因一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解 液体培养基 加血清 贮存于4 冰箱 避免光照 实验进行前放在37 水槽中温热 在无血清培养基中添加抗生素时降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50 血清蛋白会结合和灭活一些抗生素 在无血清培养条件下 抗生素不被灭活 可能对细胞达到毒性水平 血清必须贮存于 20 70 若存放于4 勿超过一个月 如果一次无法用完一瓶 可将40 45ml分装于无菌50ml离心管中 由于血清结冻时体积会增加约10 必须预留此膨胀体积之空间 否则易发生污染或容器冻裂之情形 一般厂商提供之血清为无菌 不需再无菌过滤 若发现血清有许多悬浮物 则可将血清加入培养基内一起过滤 勿直接过滤血清 血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害 而影响血清的质量 血清的热灭活是指56 30min加热已完全解冻之血清 加热过程中须规则摇晃均匀 其目的是使血清中之补体成份去活化 除非必须 一般不建议作热处理 因为会造成沉淀物显著增多 且会影响血清之品质 在免疫学研究 培养ES细胞 昆虫细胞和平滑肌细胞时 推荐使用热灭活血清 如何避免血清中沉淀物的产生 血清解冻步骤 逐步解冻法 20 或 70 至4 冰箱溶解一天 至室温下全溶后再分装 在溶解过程中须规则摇晃均匀 小心勿造成气泡 使温度与成分均一 减少沉淀的发生 勿直接由 20 直接至37 解冻 因温度改变太大 容易造成蛋白质凝结而发生沉淀 勿将血清置于37 太久 若在37 放置太久 血清会变得混浊 同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏 而影响血清之品质 血清之沉淀物凝絮物 原因多种 普遍原因是血清中之脂蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白造成 这些凝絮物不会影响血清本身之品质 若欲减少这些凝絮物 可离心3000rpm 5min去除 或离心后上清液加入培养基中一起过滤 不建议用过滤步骤去除这些凝絮物 因为会阻塞过滤膜 显微镜下观察之 小黑点 通常经过热处理之血清 沉淀物的形成会显著的增多 有些沉淀物在显微镜下观察像是 小黑点 常会误认为血清遭受污染 在37 环境下 又会使此沉淀物增多 更会误认为微生物之增殖 但以培养细菌之培养基检测 又没有污染 一般而言 此小黑点应不会影响细胞之生长 但若怀疑此血清之品质 应立即停用 更换另一批号的血清 二 细胞培养的基本技术 细胞培养的设置与设备无菌操作技术原代细胞的制备过程培养细胞的传代细胞的冻存和复苏 细胞培养的设置和常用设备 无菌操作间 超净工作台 倒置显微镜 CO2培养箱 离心机贮藏间 冰箱 低温冰柜 液氮罐清洗消毒间 干燥箱 水纯化装置 高压灭菌器 无菌操作技术 实验前准备 培养用品清洗和消毒操作间和工作台紫外消毒30 60min 勿照培养用夜 75 酒精擦拭无菌操作台面开启超净工作台风扇运转10min洗手 更衣工作台应保持清洁及宽敞 用品放置有序酒精灯在当中 培养用品在左侧 废液缸在右侧 无菌操作 火焰灭菌法一切操作如安装吸管帽 打开或封闭瓶口等都应经火焰烧灼后进行 应注意 有细胞的容器瓶口及胶塞 橡皮乳头 金属器械不可长时间烧灼 烧过的器械要冷却后使用 吸过培养液的吸管不可再用火烧灼 应分别使用不同吸管吸取培养液 PBS 细胞悬液及其它各种用液 不可混用 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口 不可在打开之容器正上方操作实验 培养瓶 培养液瓶不要过早打开 容器打开后 倾斜约45 角取用 尽量避免垂直放置 面向操作台时勿大声讲话或咳嗽 操作完毕后清除废液 废物 并用酒精擦洗台面保持洁净 细胞培养室的定期清洁和检测新洁尔灭或来苏儿清洁培养室 酒精擦拭消毒CO2培养箱注意CO2培养箱的水盘是否有水 是否有污染 用无菌水 每周更换 注意CO2钢瓶的CO2压力注意CO2培养箱的CO2浓度 温度 勿经常开关培养液门 注意超净工作台微压表 更换过滤器注意配备紫外线灯管 原代细胞制备过程 组织材料的选择和处理尽快培养 严格无菌操作单细胞悬液制备剪切组织 消化分离胰蛋白酶 细胞间质少的软组织胶原酶 纤维性组织 较硬的癌组织细胞计数及分装台盼兰拒染法计数 数左不数右 数上不数下4大格 细胞总数 2 104 4 细胞数 ml细胞培养及观察培养液颜色 是否有污染 细胞生长状况注 24h内不应镜检或摇动镜检和换液不宜在外放置过久 随用随放 培养细胞的传代 原代培养的首次传代 数量 纯度 细胞传代方法贴壁细胞的消化法传代悬浮细胞的离心法传代细胞系的维持认真记录 规律传代 换液及充足的冻存储备 贴壁细胞的消化法传代 倒掉旧培养液 以25ml培养瓶为例 向瓶内加入1ml消化液 胰蛋白酶 EDTA混合液 轻轻摇动培养瓶 使消化液流遍所有细胞表面倒掉 再加入新消化液 消化最好在37 或室温25 以上环境下进行 消化3 5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察 发现胞质回缩 细胞间隙增大后 加少许含血清的培养液 终止消化 用吸管吸取瓶内培养液 反复吹打瓶壁细胞 吹打过程要顺序进行 从培养瓶底部一边开始到另一边结束 以确保所有底部都被吹到 动作轻柔同时尽可能不要出现泡沫 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落形成细胞悬液 转入离心管中 800 1000rpm离心5min 去除上清 加入1ml新培养液 用吸管吹打分散成细胞悬液 计数 以合适比例接种在新的培养瓶或培养板中 常用培养器皿加液量和细胞数 细胞的冻存和复苏缓慢冻存 快速复苏 细胞冻存方法1 选用对数生长期细胞 在收集细胞24h前换液一次 2 消化分离细胞 按 1 5 106 ml细胞浓度 悬浮于含10 DMSO或甘油的冻存培养液中 分装于无菌冻存管中 3 冷冻管置于4 30min 20 30min 80 16 18h 或隔夜 液氮罐长期储存 细胞复苏方法1 取出冻存管迅速放入37 水浴中使其在1min内融化 2 无菌操作下打开冻存管 将细胞悬液移至离心管中 加5 10ml预温培养液 1000rpm离心5min 去上清 用培养液适当稀释后装入培养瓶中 置37 培养 次日更换一次培养液 三 细胞培养污染与监测 细胞污染种类微生物污染细胞交叉污染化学物质 细胞污染预防措施加抗生素 青霉素100u mL 链霉素100 g mL 无菌操作及规范操作冷冻保存未污染细胞株无菌室的彻底消毒 高锰酸钾甲醛熏蒸 污染来源空气器材处理和操作不当血清和组织样本 细菌 培养液一般会浑浊变黄 对细胞生长影响明显 可见胞内颗粒增多 增粗 最后变圆脱落死亡 根据感染细菌的不同 可有不同的外形 真菌 可见培养液中漂浮着白色或浅