谷丙转氨酶活性测定.ppt

实验十七谷丙转氨酶活性测定Exp 17ActivityDeterminationofGlutamicPyruvicTransaminase 一 实验原理 氨基移换酶也称转氨酶 为广泛存在于生物机体内的酶 其作用为催化 氨基酸的 氨基与 酮酸的 酮基互换 因此在氨基酸的合成和分解 尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用 转氨酶的种类甚多 任何一种氨基酸进行转氨作用时 都由其专一的转氨酶催化 它们的最适pH接近7 4 在各种转氨酶中 谷氨酸 草酰乙酸转氨酶 简称谷草转氨酶 及谷氨酸 丙酮酸转氨酶 简称谷丙转氨酶 活力最强 上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内 在正常人血清中也有少量 机体发生肝炎 心肌梗塞等病变时 血清中转氨酶活力显著增加 所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义 它们的催化反应如下 测定转氨酶活力的方法很多 如分光光度法 纸上层析法等 在本方法中 谷丙转氨酶作用于丙氨酸和 酮戊二酸后 生成的丙酮酸与2 4 二硝基苯肼作用生成丙酮酸2 4 二硝基苯腙 本方法中用分光光度法 根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力 二 实验用品 1 材料新鲜动物肝匀浆 2 试剂 1 0 1M磷酸缓冲液 pH 7 4 取0 1MKH2PO4液50ml 0 1NNaOH液39 3ml 再加蒸馏水10 7ml 混匀即得 2 丙酮酸钠标准液 2 0微克分子 ml 取A R丙酮酸钠11mg溶解于50ml0 1M磷酸缓冲液内 宜当日新配 3 谷丙转氨酶底物 取分析纯 酮戊二酸29 2mg DL 丙氨酸1 79g置于小烧杯内 加1NNaOH约10ml至完全溶解 用1NNaOH或1NHCl校正其pH 7 4 加0 1M磷酸缓冲液稀释至100ml 然后加氯仿数滴防腐 在冰箱内可保存一周 此溶液每1 0ml含 酮戊二酸2 0微克分子 丙氨酸200微克分子 4 2 4 二硝基苯肼溶液 将A R纯2 4 二硝基苯肼19 8mg加入200ml锥形瓶内 加100ml1NHCl液 2 4 二硝基苯肼溶解较慢 把锥形瓶放在暗处不时摇动 全部溶解后 滤入褐色玻璃瓶 并置于冰箱中保存 5 0 4N氢氧化钠液 3 仪器设备试管 吸量管 恒温水浴锅 分光光度计 三 方法和步骤 1 肝匀浆制备 取新鲜动物肝脏 用生理盐水冲洗 滤纸吸干 称取肝脏0 5g 剪成小块 置于玻璃匀浆管内 加入4 5ml预冷的pH7 40 1mol L磷酸缓冲液 制成10 肝匀浆 冰冻保存 2 标准曲线的绘制取6支试管分别用0 1 2 3 5标号 按下表所列次序添加各试剂 将试管于37 水浴中保温 平衡管内外温度 向各管内加0 5ml2 4 二硝基苯肼后再保温20分钟 最后分别向各管内加入0 4NNaOH5毫升 在室温下静置30分钟后 以0号管做 空白 用520nm进行比色 读出光吸收值 以丙酮酸的微摩数为横坐标 光吸收值为纵坐标 画出标准曲线 表1 丙酮酸钠标准曲线的绘制 表2 谷丙转氨酶酶活力的测定 2 谷丙转氨酶酶活力的测定 四 实验结果 用光吸收值读数在操作曲线上查出转氨酶活力单位数 计算每