原位PCR.doc

鼠科常用实验品种介绍大鼠来源 大鼠（RAT）学名Rattus norvegicus,在生物分类学上属脊椎动物门、哺乳动物纲、啮齿目、鼠科、家鼠属、褐家鼠种。 生活习性 生长发育：新生大鼠体重约5-6颗，45天体重可达180克以上，此时可供试验用。成年雄性大鼠体重可达300-800克，此行可达200-400克。 活动规律：大书喜啃咬，白天常挤在一起休息，夜间活动，晚上活动量大，采食量良多，食性广泛，喜肉食。对光照、噪音敏感。 繁殖特性：大鼠2月龄性成熟，性周期4-5天，妊娠期为19-21天，哺乳期为21天，每台产仔平均8支。可根据引导涂片观察性周期中引导上皮变化，判断性周期中各个时期中卵巢、子宫与垂体激素变化的状态。 常用品系 SD大鼠: 生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。 该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。 一般生物学特性 繁殖性能：产仔率：9295 ；平均窝产仔数：9.9612.07只 ；胎间隔：2852天；离乳存活率：9598。 Wistar大鼠 ：Wistar大鼠由美国费城Wistar研究所育成。常用的既有近交系，也有远交群。其被毛呈白色，特征为头部较宽、耳朵较长、尾的长度小于身长。Wistar大鼠性情温顺，性周期稳定，早熟多产，平均每窝产自10只左右，生长发育快，乳腺癌发病率很低，对传染病抵抗力强。 Fisher 344大鼠：简称F344大鼠，1920年由哥伦比亚大学肿瘤研究所Curtis育成。我国从美国国立卫生院引进。书近交系大鼠，其被毛呈白色。平均寿命2-3年，旋转运动性低，血清胰岛素含量低。原发和继发性脾红细胞免疫反应性低。乳腺癌、脑垂体腺瘤、甲状腺瘤、睾丸间质细胞瘤发病率高。广泛用于毒理学、肿瘤学、生理学等领域。 SHR大鼠：又称自发性高血压大鼠，1963年 由日本精都大学医学部Okamoto从Wistar大鼠种选育而成。属突变系大鼠，其被毛呈白色。SHR大鼠自发性高血压发病率高，且无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，心血管发病率高。但其生育能力，存货寿命无明显下降。 ACL大鼠：ACL大鼠由哥伦比亚大学肿瘤研究所Curtis和Dunning培育。属近交系大鼠。其被毛呈黑色，腹和脚呈白色。平均寿命2-3年，易发生先天性畸形，肿瘤发病率高。其仔鼠矮小，繁殖力差，胚胎死亡率高。 应用领域 1 生理学研究 大鼠在生理学研究中以多用途行为特征。大鼠垂体肾上腺系统发达，垂体摘除比较容易。可用来进行肾上腺、垂体和卵巢等内分泌研究。利用大鼠对新环境易适应，有探索性，易训练，对惩罚和暗示敏感的特性进行行为学研究和高级神经活动的研究。大鼠无胆囊，但胆总管较大，可用胆总管插管，收集胆汁，研究消化功能。 2 营养学研究 大鼠是第一种用于营养学研究的实验动物，为人类营养研究做出了突出贡献，维生素D就是用大鼠研究而发现的。由于大鼠杂食，解剖、生理与人相似，生长代谢快，对大鼠的营养研究广泛而细致，资料极为丰富，常用于维生素、蛋白质缺乏，氨基酸和钙磷代谢的研究 3 代谢性疾病研究 可应用大鼠研究动脉粥样硬化，淀粉样变性、酒精中毒，十二指肠溃疡，营养不良等代谢病 4 药物学研究 大鼠血压和血管阻力对药物反应敏感，适合研究心血管药物的药理。研究毒扁豆碱的升压作用。此外，大鼠足趾浮肿法是最常用的筛选方法，大鼠踝关节对炎症反应敏感，用于关节炎药物研究。大鼠还是进行药物评价的主要实验动物。 5 肿瘤研究 很多肿瘤可以移植到大鼠上进行研究，大鼠易患肝癌，可人工复制大鼠肝癌、食管癌动物模型。可皮下接种淋巴肉瘤。 6 遗传学研究 大鼠的毛色变型很多，可用来研究毛色记忆遗传，验证孟德尔遗传定律。由遗传疾病的大鼠，具有与人相似的表现。脑积水、听觉障碍、耳聋、白内障、垂体矮小症、无牙、无胆汁、丘脑下部尿崩症、肥胖与高血压等都是遗传疾病的良好动物模型，还可制成相似于人的实验诱发性遗传缺陷疾病动物模型。 7 传染病研究 用于研究副伤寒、流感、厌氧菌、假结核、霉型体、巴氏杆菌、葡萄球菌、念珠状链杆菌、黄曲霉菌和烟曲霉菌等微生物及其引起的传染病。 8 某些疾病研究 如支气管肺炎、多发性关节炎、化脓性淋巴腺炎、中耳疾病和内耳炎。大鼠肝切除60%至70%，仍有再生能力，可用于肝外科实验。 9 牙科学研究 用变异链球菌接种大鼠口腔，然后喂给含蔗糖食物，大鼠牙齿上的确琅质蛀损在宏观和微观上同人的蛀齿相似，可用来研究龋齿。 10 大鼠还可用于计划生育的畸胎学、避孕药研究和放射学研究。 SD大鼠: 生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。 该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。 一般生物学特性 繁殖性能：产仔率：9295 ；平均窝产仔数：9.9612.07只 ；胎间隔：2852天；离乳存活率：9598。 Wistar大鼠 ：Wistar大鼠由美国费城Wistar研究所育成。常用的既有近交系，也有远交群。其被毛呈白色，特征为头部较宽、耳朵较长、尾的长度小于身长。Wistar大鼠性情温顺，性周期稳定，早熟多产，平均每窝产自10只左右，生长发育快，乳腺癌发病率很低，对传染病抵抗力强。 原位PCR原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术，就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。 做原位PCR时组织处理有何要求？ 处理后的标本，既要保持组织，细胞的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引物、探针能有效进入胞浆中发生反应。 原位PCR实验主要的应用范围有哪些？ 主要应用于两方面；（1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）检测导入基因；（） 遗传病基因检测如地中海贫血。 原位PCR实验的大致过程是什么？ 实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。 做原位PCR实验玻片怎么处理？ 清洁液清洗自来水冲，烘干强酸24h自来水，蒸馏水洗，烘干95乙醇数小时烘干，高压消毒。再用多聚赖氨酸APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)包被。 固定液的选择标准是什么？ 保持组织结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平，使引物和探针更易于进入细胞内，在规定的时间内进行反应。 原位PCR实验所采用的组织固定液和固定时间有哪些？ 固 定 剂 固 定 时 间 细 胞 组 织 甲醇丙酮(1:2) 4min 20min 甲醇丙酮(1:1) 4min 20min 4多聚甲醛 30min 60min 2戊二醛 30min 60min 10中性福尔马林 overnight overnight 原位PCR的基本方法为 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K。PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。显微镜观察结果。待检石蜡切片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性DNA和RNA经核酶充分消化后，通过生物素化单抗与亲和素系统的桥联，将生物素化的DNA报告分子固定在石蜡切片上，进行原位PCR扩增，扩增产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是否存在。PCR和原位PCR在概念上有什么区别？ PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增，不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。 PCR所采用的反应体系能否应用于原位PCR，各反应成分有什么异同？ PCR与原位PCR所采用的反应体系中都包括Taq聚合酶缓冲液、Mg2、K、4dNTP、一对特异性引物和Taq聚合酶。但是由于组织细胞间质会吸附Mg2，所以原位PCR中采用的Mg2浓度要比PCR的要高，采用4.5-5.5mM可以保证有足够的Mg2进行反应。另外由于原位PCR中的基因扩增过程中，各反应成分须经过渗透到靶DNA处才能进行扩增，所以建议将反应循环数增加到35 个。 做原位PCR需要什么特殊设备？ 原位PCR反应是在载玻片的平面上进行，保持水平可以使反应各组分均匀地分布在组织切片上，所以须在原位PCR仪上进行，该仪器不但可以使载玻片保持水平，而且还可以给载玻片进行均匀地加热，保证扩增反应的顺利进行。 用于原位PCR检测的探针有哪些？ 与原位杂交一样，检测原位PCR结果的探针可以是DNA探针，也可以是寡核苷酸探针，DNA探针的长度在100200bp为宜，寡核苷酸探针为多个，在2040bp为宜。 用于原位PCR检测的探针标记物有哪些？ 常用标记物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），过氧化物酶（HRP），还可以标记一些荧光物质如异硫氰酸荧光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。 怎样设定原位PCR对照实验？ 设立阳性对照，即用已知阳性细胞或组织切片做阳性标志，实验结果应呈阳性，表明实验方法准确可靠。同时要设立阴性对照，即用已知阴性细胞或组织切片作阴性对照，实验结果应呈阴性，表示实验方法无假阳性结果；也可以用实验细胞或组织切片，不加标记的dUTP（直接法），PCR结果显示阴性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，结果均应阴性。 原位PCR中直接法和间接法有何异同？ 直接法：进行原位PCR扩增以前，把同位素或非同位素(常用)标记的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)标记的底物或引物5末端连接标记物加入PCR反应液中，随着扩增的进行，标记的核苷或引物直接掺入到PCR产物中，然后免疫组化直接进行检测。间接法：先进行细胞内目的DNA基因原位扩增，然后用标记的探针进行核酸分子原位杂交以定位检测扩增的的技术，步骤相对较多，需时长，但结果可靠。 获得特异的原位PCR结果需要考虑哪些关键因素？ 原位PCR技术操作包括了组织学技术、PCR技术、原位杂交技术及免疫组化学技术，因此在复杂的操作过程中，有很多因素影响实验结果。要考虑的一些关键因素有待检组织的有效固定，在PCR前的组织预处理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR环节中要设计特异的扩增引物、Mg2的浓度、TaqDNA聚合酶用量、反应循环参数。间接法中用原位杂交检测时考虑探针浓度、抗体浓度和显色时间。 原位PCR中的组织预处理和原位杂交是否相同？ 要获得理想的原位PCR结果，需要将待检组织进行预处理使核酸充分暴露，这和原位杂交组织预处理的原则相同。因此原位杂交中的组织预处理步骤如HCL和蛋白酶处理等同样适用于原位PCR。 PCR相比，原位PCR有什么优势和不足？ PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的D