革兰染色法.doc

实验一 革兰染色法、细菌的特殊染色法实验目的：掌握细菌革兰染色的原理与方法；掌握细菌芽孢染色的基本原理与方法；熟悉普通光学显微镜的油镜使用与保养方法。实验材料：菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 试剂：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红花红、孔雀绿实验内容：1.革兰染色染色方法：革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G)；如被脱色，而染上复染液的颜色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。染色原理：现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交联度大，脂类含量少，经95乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）干燥固定初染（结晶紫染色1min）媒染（碘1min）水洗95%乙醇脱色（1min）复染（番红花红染色1min）干燥镜检（油镜）注意事项：（1）菌种应选用对数期的菌种；（2）涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好；（3）脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间取决于涂片厚度、室温等。2.芽孢染色芽孢是某些细菌在生长发育的后期在细胞内形成的圆形或椭圆型的抗逆性比较强的休眠体，是细菌的一种特殊构造。染色原理：芽孢是利用细菌细胞不同部分与染料的亲和力不同，用特殊染色法使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。芽孢具有厚而致密的壁，折光性强，通透性低，不易着色，用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（呈无色透明）。芽孢色法就是根据芽孢具有既难以染色而一旦染上色后又不易脱色的特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则，既除了用着色力强的染料外，还需要加热或延长染色时间等，促进标本着色。然后使菌体脱色而芽孢上的染料仍保留。经复染后，菌体和芽孢呈不同的颜色，这里采用孔雀绿染色法。此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用沙黄进行复染，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色，使之呈现不同的颜色，以便显微镜观察。染色过程：涂片（枯草芽孢杆菌）干燥固定初染（孔雀绿染色20-30min）水洗复染（番红花红染色1min）干燥镜检注意事项：（1）涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，（2）水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。（3）涂片在干燥过程中，不易在火焰远端加热干燥。3.显微镜油镜的使用与保养使用方法：（1） 在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。（2） 用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细调节器至物象清晰为止。（3） 如果不出现物象或者目标不理想要重找。（4） 油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。注意事项：（1） 持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。（2） 轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。（3） 保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。（4） 水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。（5）（5）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。（6） 使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上外罩，放回实验台柜