第八章 微生物遗传与变异.doc

第八章 微生物遗传和变异第一节 微生物的遗传和变异遗传(heredity)：亲代生物的性状在子代得到表现；亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。 特点：具稳定性。遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部基因的总和；-是一种内在可能性或潜力。表型（phenotype）：指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在，是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。遗传型 + 环境条件 = 表型表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。l 变异：亲代与子代及子代个体之间，在形态结构和生理特性上的差异。l 微生物的变异分为遗传性变异和非遗传性变异。l 遗传性变异：是细菌的基因结构发生了改变，故又称 基因型变异。常发生于个别的细菌，不受环境因素的影响，变异发生后是不可逆的，产生的新性状可稳定地遗传给后代。l 非遗传性变异：细菌在一定的环境条件影响下产生的变异，其基因结构未改变，称为表型变异。易受到环境因素的影响，凡在此环境因素作用下的所有细菌都出现变异，而且当环境中的影响因素去除后，变异的性状又可复原，表型变异不能遗传。l 遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。一 微生物遗传变异的特点个体的体制极其简单；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；繁殖速度快，生活史周转快，容易发生变异；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；菌落形态特征的可见性和多样性；环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；各种微生物一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；微生物是遗传学研究中的明星：l 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。l 很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。l 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。二 变异的类型 1 形态结构的变异l 大小和形态在不同的生长时期可不同，生长过程中受外界环境的影响也可发生变异。如：鼠疫耶氏菌在陈旧培养物上细菌的多形态性、细菌L型。l 特殊结构如：荚膜（肺炎链球菌）、芽胞（炭疽芽孢杆菌）、鞭毛（变形杆菌H-O变异）也可发生变异。2 毒力变异l 毒力增强：无毒力的白喉棒状杆菌常寄居在咽喉部，不致病；当感染了-棒状噬菌体后变成溶原性细菌，则获得产生白喉毒素的能力，引起白喉。l 毒力减弱：有毒菌株长期在人工培养基上传代培养，可是细菌的毒力减弱或消失。卡介苗(BCG)是有毒的牛分枝杆菌在含有胆汁的甘油、马铃薯培养基上，经过13年，连续传230代，获得的一株毒力减弱但仍保持免疫原性的变异株。3 耐药性变异l 耐药性变异：微生物对某种抗菌药物由敏感变为耐药的变异。有些微生物还表现为同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性。l 耐药性变异成为当今医学、农业上的重要难题。4 菌落变异l 细菌的菌落主要有光滑(smooth,S)型和粗糙(rough,R)型两种。S型菌落表面光滑、湿润、边缘整齐。经人工培养多次传代后菌落表面边为粗糙、干燥、边缘不整齐，称SR变异。l SR变异常见于肠道杆菌，是由于失去LPS的特异性寡糖重复单位而引起的。l 变异时不仅菌落的特征发生改变，且细菌的其它性状也发生了变化。l S型菌的致病性强，但有少数R型菌的致病性强，如结核分枝杆菌。三 研究微生物遗传学的意义微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究，不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展，而且为育种工作提供了丰富的理论基础，促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。筛选菌株，控制性状，满足要求。第二节 微生物的遗传、变异的物质基础l 种质连续理论：1883 -1889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。l 基因学说：1933年摩尔根（Thomas Hunt Morgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。一 、遗传和变异的物质基础核酸l DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验），才使人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。1 证明核酸是遗传物质的三个经典实验l （1）经典转化实验（transformation）(P204)l 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌）l SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性l RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性l 1928年，Griffith进行了以下几组实验：l 动物实验对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡l 1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。一、DNA作为遗传物质分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性DNA是转化所必需的转化因子1941年，Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验细菌培养实验热死SIII菌不生长活 RII 菌长出RII菌活RII菌和热死SIII菌长出大量RII菌和少量SIII菌l S型菌的无细胞抽提液试验l 活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌l 以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。（2）噬菌体感染实验l A. D. Hershey和M. Chase， 1952年（3）植物病毒的重建实验l 为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。l 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：TMV HRV（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。二、朊病毒的发现与思考亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚未发现该蛋白内含有核酸。其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。Prusiner (1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒particle），并将之称做Prion或Virino -朊病毒1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖三、 基因和遗传信息的传递1、基因（gene）是一段DNA基因是遗传信息的功能单位。基因表达就是将基因所携带的遗传信息释放出来指导生物体性状表达的过程。基因表达的过程是十分复杂的，具有不同的形式和精确的调控。2、基因分类l 结构基因：l 在生物体内，大部分遗传性状都是直接或间接通过蛋白质表现出来的。l DNA RNA protein l 调节基因（启动子和终止子）l 与RNA转录起始相关的顺式调控元件称为启动子l 与转录终止有关的顺式调控元件称为终止子。l 操纵基因l 几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起，由同一个调控系统来控制。l 这样的一个整体称为一个操纵元(operon)。 第三节 质粒和转座因子质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。转座因子（transposable element）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。质粒和转座因子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子一、质粒性质：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。对于细菌的生存并不是必要的功能多样化l 功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。l 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。l 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella（志贺菌属）、Streptococcus lactis（链球菌）、根癌土壤杆菌等l 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法二、质粒的分子结构1、结构通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）2、质粒的检测l 提取所有胞内DNA后电镜观察（P211图8-3）；l 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；l 对于实验室常用菌，可用质粒所带 的某些特点，如抗药性初步判断。三、质粒的主要类型致育因子（Fertility factor，F因子）抗性因子（Resistance factor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（cryptic plasmid）质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应1、致育因子(Fertility factor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。l 环状双链DNA，编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。2、抗性因子（Resistance factor，R因子）抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）细菌素结构基因:涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质的基因、赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因。一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。5、代谢质粒（Metabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。降解质粒：将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。假单胞菌：只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。巨大质粒（mega质粒）是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200-300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。6、隐秘质粒（cryptic plasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）7 毒性质粒许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒Ti质粒（tumor inducing plasmid）诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。质粒的不亲和性，教材p214四、转座因子（transposible element）l 1951年巴巴拉麦克林托克提出转座（Transposition）和跳跃基因(jumping gene)的新概念l 1967年Shapiro才在E.coli中发现了转座因子（transposable element）。l 1983年,美国遗传学家巴巴拉麦克林托克（BMcClintock）由于发现了可移动的遗传物质，被授予诺贝尔医学奖。l 1、旧概念：基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段。l 2、新发现：有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。l 转座因子（transposible element）：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene）。3、 转座的遗传学效应，教材P217l 插入突变l 产生染色体畸变（复制性转座子）l 基因的移动和重排第四节 基因突变及修复基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变本质基因突变-DNA损伤修复前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。自发突变：环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。诱变：某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。一、基因突变的特点1、特点 P219适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。2、实验证据如何证明基因突变的非对应性？三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！变量实验：彷徨试验(fluctuation test):证明微生物群体中的变异株是来自由自发性突变所创造的一种方法二、常见的微生物突变类型基因型-表型依表型的改变分为：形态突变型指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。菌落颜色变化 、芽孢缺陷菌株等。营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型。抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性。条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变。产量突变型通过基因突变而获得的在有用代谢产物上高于原始菌株的突变株 。 1）营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物才能生长。表型判断的标准：在基本培养基上能否生长营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长2）抗药性突变型（resistant mutant）基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）4）形态突变型（morphological mutant）三、诱变剂与致癌物质Ames试验：很多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变，进行诱变育种；b）对有害微生物进行控制；c）危害人类自身的健康 “生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。 诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率，与其对动物的致癌性成正比 1、Ames实验定义：利用细菌回复突变来检测环境中存在的致癌物质的方法。此法由美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变主要步骤：将样品与鼠肝匀浆保温，吸入滤纸片中，将滤纸片置于含有鼠伤寒沙门氏菌的his菌株的基本培养基上，保温后观察结果。可能出现3种情况：1）平板上无大量菌落生长，说明样品中不含致癌物。2）如纸片周围有一抑菌圈，其外才是大量菌落，说明样品中致癌物浓度较高。3）如纸片周围长出大量菌落，说明样品中含有致癌物。 实践意义：广泛用于检测食品、饮料、药物、饮水等试样中的致癌物，此法快速、准确、费用省。 2 基因突变机制（诱变）诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂.种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。（1）碱基置换（substitution）l 定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。l 分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶,或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，即可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。直接引起置换的诱变剂l 定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。若干诱变剂的作用机制及诱变功能诱变因素在DNA上的初级效应遗传效应碱基类似物掺入作用AT=GC双向转换羟 胺与胞嘧啶起反应GCAT的转换亚硝酸A、G、C的氧化脱氨作用交 联AT=GC双向转换 缺失烷化剂烷化碱基（主要是G）烷化磷酸基团丧失烷化的嘌呤糖-磷酸骨架的断裂AT=GC双向转换ATTA的颠换GCCG的颠换巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）丫啶类碱基之间相互作用 双链变形码组移动（或）紫外线嘧啶的水合物形成嘧啶的二聚体交 联GCAT转换码组移动（或）电离辐射碱基的羟基化核降解DNA降解 糖-磷酸骨架的断裂丧失嘌呤AT=GC双向转换码组移动（或）巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）加热C脱氨基CGTA转换Mu噬菌体结合到一个基因中间码组移动间接引起置换的诱变剂l 这类诱变剂主要是一些碱基类似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等； l 作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。l 以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的类似物 ，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BUl 可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。（2） 移码突变（frame-shift mutation 或 phase-shift mutation）l 指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。l 由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。l 丫啶类染料，包括原黄素、丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列称为ICR类的化合物，都是移码突变的有效诱变剂。l 引起移码突变的诱变剂：主要是吖啶类染料，如吖啶黄、吖啶橙等等。l 这类化合物都是平面型的三环分子，它们的结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似。能诱发移码突变的几种代表性化合物（3）染色体畸变（chromosomal aberration）l 某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，它包括：l 染色体结构上的变化：l 缺失（deletion）l 重复（duplication）l 易位（translocation）l 倒位（inversion）l 染色体数目的变化染色体结构上的变化l 分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。l 染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，l 如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；l 如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。l 倒位-是指断裂下来的一段染色体旋转180后，重新插入到原来染色体的原位置上，从而使其基因顺序与其它的基因顺序相反；l 易位-是指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。l 染色体间畸变：指非同源染色体间的易位。3 紫外线对DNA的损伤及其修复l 已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。发现较早和研究得较深入的是紫外线（U.V.，ultraviolet ray）的作用。l 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。l 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。（1） 光复活作用（photoreactivation）定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。l 经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。l 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。（2） 暗修复作用（dark repair）l 又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。这种修复作用与光无关。有四种酶参与内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从而完成了修复作用。暗修复作用（dark repair）1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。（3） 紫外诱变方法设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等，紫外灯：波长为253、7nm, 功率是15W，处理时的照射距离：20cm 30cm样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm，照射时，要用磁力搅拌器搅拌。处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。生产上经常采用的剂量：死亡率为70%80%左右（4） 重组修复细胞在不切除二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，但在每个二聚体附近留有一空隙。通过染色体交换，空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种条件下，DNA聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复，重组修复中的DNA损伤并没有去除，但随着微生物的传代繁殖，损伤的比例逐渐降低。必须在DNA复制的情况下进行，所以又叫复制后修复。 (5)SOS修复： 当DNA损伤广泛难以继续复制时，应急而诱发产生的一系列复杂 的修复反应。各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复使DNA保留的错误较多，会引起较广泛、长期的突变。第五节 基因的转移与重组l 基因转移(gene transfer)：外源性的遗传物质由供体菌进入某受体菌细胞内的过程。l 基因重组(recombination)：转移的基因与受体菌DNA整合在一起，使受体菌获得供体菌某些特性。l 外源性遗传物质：供体菌染色体DNA，质粒DNA及噬菌体基因等。l 细菌的基因转移和重组方式：转化、接合、转导。1. 转化(transformation):供体菌裂解游离的DNA片段转入某受体菌细胞内的过程。同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程感受态：细菌能从周围环境吸取DNA的生理状态。包括自然感受态和人工感受态。感受态细胞（competent cell） ：具有摄取外源DNA能力的细胞自然感受态的出现是细胞一定生长阶段（对数生长期后期）的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）1）、自然遗传转化（简称自然转化）转染(transfection)：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染（2）、人工转化在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。质粒的转化效率高；2. 接合(conjugation)(P225)接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。能通过结合方式转移的质粒称为接合性质粒，不能通过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。实验证据接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛F因子的四种细胞形式a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。 细胞表面同样有性菌毛。F+F-杂交F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株Hfr F-杂交：Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。3）FF-杂交细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。3. 转导(transduction)l 转导：是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，是受体菌获得新的性状。l 根据转导基因片段的范围，可将转导分为两类：普遍性转导（转导的DNA可是供菌染色体上的任何部分）、局限性转导（转导的DNA只限供菌染色体上的特定基因）。 (1)普遍性转导：噬菌体可以包被细菌染色体的任何部分到噬菌体内的过程意外的发现 导的基本要求：形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。 导的三种后果：DNA不能复制，因此