生化分离技术思考题答案解析(1-6章).doc

生化分离技术思考题答案解析生化分离第一章1. 简述生化分离技术在生物技术中的地位和主要作用。2.生化分离技术的主要种类及特点。种类：细胞破碎 (cell disruption) 、沉淀分离(precipitation) 膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography)、电泳分离(electrophoresis)、 离心分离（centrifugation）特点：成分复杂、含量甚微、易变性，破坏、具经验性、均一性的相对性3何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成) 2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。 如膜过滤与亲和配基、离子交换基团相结合，形成了亲和膜过滤技术、亲和膜色谱、离交膜色谱；亲和配基和聚合物沉淀作用相结合，形成亲和沉淀技术等等。（P5）4.说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处。1选材，来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少 2.提取：将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关。3.分离纯化：核心操作，须据目的物的理化性质，生物学性质及具体条件定。4.浓缩、结晶、干燥。5、保存。整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。胞内产物需要破壁的过程：需要将目的物从胞内转移到外界溶液中，需要细胞提取物破碎、匀浆、离心，如果是液体的话，获得提取液，如果是想获得固体目的物，就对沉淀进行洗涤再获得提取物。生化分离第二章1、简要说明常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发展方向。答：常用的细胞破碎方法有：组织捣碎、珠磨法、高速匀浆法、挤压法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法、干燥法等。1 组织捣碎，其原理是利用机械运动产生剪切力的作用破细胞，利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。（1000020000r/min）；适用范围：动植物组织。2 珠磨法，工作原理是：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物；特点：一般可以达到较高的破碎率，但同时为控制温度，冷耗能耗较高，成本亦随之增加；适用范围：微生物（细菌）与植物细胞。3 高速匀浆法，工作原理：利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂；特点：破碎程度较高，而其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大；适用范围：较柔软、易分散的组织细胞。4 挤压法，工作原理：微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎；适用范围：细菌（革兰氏阴性菌）5 超声破碎法，工作原理：声频高于15-20kHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，破碎机理不详，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关，空化现象是在强声波作用下，气泡形成、胀大和破碎的现象；特点：多采用短时多次处理样品，且由于过程产热较多，常在冰浴中进行超声；处理少量样品，操作简便，液量损失少；适用范围：微生物细胞。6 酶溶法，又分为外加酶和自溶两种，外加酶原理：用生物酶将细胞壁核细胞膜消化溶解；特点：具有选择性释放产物、核酸泄露少、细胞外形完整，但价格较高、通用性差。自溶法。原理：控制一定条件，诱发微生物细胞产生过剩的溶胞酶或激发溶胞酶活力，使细胞自溶；特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性。7 化学渗透法，原理：某些有机溶剂、表面活性剂、抗生素等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择的渗透出来；特点：对产物释放有一定的选择性，细胞外形保持完整，浆液黏度低，但反应时间长，效率低，有毒。8 干燥法，原理：细胞壁膜的结合水丧失，改变细胞渗透性。又分为热空气干燥（适用酵母）、真空干燥（适用细菌）、冷冻干燥（制备不稳定的酶）。9 急热骤冷法，原理：将材料投入沸水，维持8590数分钟，冰浴中急速冷却，使胞壁结构破坏；适用范围：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取。10 反复冻融法，原理：将材料深冷（-15-20），形成水晶，破坏胞膜疏水键，增加亲水性，反复可破细胞；适用：动物材料。细胞破碎技术研究发展方向：1 多种破碎方法相结合 2与上游技术相结合 3 与下游技术相结合。2、抽提的含义是什么？影响抽提有效成分的主要因素有哪些？答：抽提是从一种固体或一种液体混合物中将所要的物质根据其特性用溶剂提取分离出来的方法。1. 离子强度 :影响物质溶解度的主要因素。 适当的低离子强度溶液（0.050.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。 2pH 影响目的物的溶解度及稳定性。 一般控制在pI附近的稳定性范围内。3添加剂:抑制剂（主要水解酶抑制剂）如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。 保护剂（稳定性）如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂3、在生物活性物质的提取中，怎样选这合适的提取剂？造成提取液混浊的主要原因是什么？如何解决？答： 在生物活性物质的提取中，选择提取剂的要求：目的物溶其中，保活性，减杂质量。考虑因素如下：1. 离子强度影响物质溶解度的主要因素。适当的低离子强度溶液（0.050.2mol/l）除增加溶解度，还对活性有稳定作用。2pH影响目的物的溶解度及稳定性。 一般控制在pI附近的稳定性范围内。3添加剂抑制剂（主要水解酶抑制剂），如提取核酸时，添加核酸酶抑制剂防目的物被分解。保护剂（稳定性），如对含巯基的酶添加谷胱甘肽等巯基保护剂另外提取剂的用量，对于目标：收率（80%以上）且目的物浓度大时：动物、微生物加1.53体积的提取剂；植物加入0.51体积的提取剂。造成提取液混浊的主要原因是蛋白质和核酸等杂质未除净；使提取液澄清的方法有：粒子聚结（增大颗粒粒径）25%（NH4）SO4处理（适用于动物细胞）酸化法降低提取液粘度 NA（DNA、RNA），类树胶等易造成粘度大。（适用于微生物细胞）其他方法 80%硫胺或55%丙酮，使蛋白质沉淀类树胶不沉淀； 吸附法； 改善破碎方法。4、试比较在分离制备蛋白质、多糖和核酸的过程中所用方法的通用性，并说明为什么？答：这些大分子物质大多存在于胞内，对于蛋白质、多糖、核酸的提取，首先要进行细胞破碎，主要包括机械法和非机械法，但破碎过程中都尽可能保证目的物不失活。在提取过程中尽量除去杂质，对于这些生物活性物质，为防止酚类物质及氧化剂的影响，一般在提取过程中都需要加入保护剂及抑制剂。对于除杂处理，在这三种物质的提取中，相同杂质去除亦有着相似的方法。比如在提取核酸或多糖时，去除蛋白质的方法，均可使用蛋白质变性剂使蛋白沉淀，亦或采用苯酚、氯仿抽提除蛋白。对于无机盐及低分子量的有机物质可用透析法、离子交换树脂或凝胶过滤法除去；对于大分子杂质可用酶消化(如蛋白酶、木质素酶)，乙醇或丙酮等溶剂沉淀法或金属络合物法。5、简述盐析分级范围的选择依据。某纯酶和粗酶的盐析分级范围是否相同？为什么？答：在分离混合蛋白质的过程中，不同蛋白质的盐析峰有重叠，盐析范围要权衡纯度和回收率进行选择。各种酶和蛋白质的沉淀曲线的Ks相差不大，因此盐析的最适分级范围在8%左右，如一种蛋白在此范围内约有90%的蛋白质能沉淀下来，若盐析范围加宽，虽可提高回收率，但可能会带入杂蛋白，使盐析的分辨率降低。同一种蛋白酶的纯酶和粗酶的盐析分级范围不同。对于纯酶，因其含有杂质较少，在纯度较高的前提下，盐析分级范围可以适当加大，以期提高酶的回收率；对于粗酶，含有较多的杂蛋白，在分离的起始阶段应先考虑除去杂质，提高纯度，故盐析范围应适当减小。6、确定盐析分级宽或窄的原则是什么？如何操作？答：不同蛋白质盐析峰有重叠，须权衡纯度与回收率进行选择。盐析沉淀的最适分级范围在8%左右，一种蛋白质在这个范围内约有90%蛋白质能沉淀下来，若分级范围加宽，尽管能提高回收率，但可能引入较多杂蛋白，是盐析分辨率降低。可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑） 举例说明 取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围 试验组别饱和度范围酶沉淀（%）蛋白沉淀（%）纯化倍数A0404250.9406062222.8608032321.0802210.045B0456320.19457090382.4704300.13C04810350.29486575253.06515400.38如需回收率高，可取40 80，94%回收率，纯化倍数1.9 需高纯度，可取48 65，75%回收率，纯化倍数3.07、简述盐析分离的原理，可采用什么措施提高盐析效率？答：低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大，这一现象称为盐溶；但当中性盐浓度增一定时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀，此现象称为盐析。纯一单蛋白质盐析公式： lgS = KsIS为蛋白质溶解度（g/L）；为I=0时lgS，它取决于溶质的性质；Ks为盐析常数，主要决定于加入盐的性质及Pr性质。I为盐浓度（mol/L）其中Ks与蛋白质性质和盐的种类有关，与pH、温度无关；与蛋白质性质、盐的种类、pH、温度均有关系。所以对于某种蛋白质的盐析提取过程，要提高盐析效率，主要从盐的种类、pH、温度等方面考虑。其中，对于盐的选择，可使用的中性盐有：(NH4)2SO4 Na2SO4 MgSO4 NaCl NaAc Na3PO4 柠檬酸钠 硫氰化钾等以(NH4)2SO4 Na2SO4最广泛，前者最受欢迎。pH影响值，进而影响了蛋白质的溶解度，故在其他条件一定时，通过改变pH也可实现蛋白质的分离。在高离子强度的溶液中，升高温度可使值下降，若在保证蛋白质不失活的情况下，可使蛋白质溶解度下降，加快盐析过程。此外，蛋白液的浓度对沉淀有双重影响，蛋白浓度越高，盐的饱和度极限越低，但杂蛋白的共沉淀现象也随之加重，故一般控制蛋白浓度在2.5-3%。8、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶回收率的原因是什么？如何解决？答：植物酶提取过程，影响酶回收率的主要因素是酚类物质的去除程度，此外还有温度、pH、搅拌剪切等因素。操作要求包括： 温度尽可能低； 提取液的量要保证“充分浸入”； 加入足量酚类吸附剂； 加入足量氧化酶抑制剂； 搅拌转速要恰当； pH要控制在合适范围，一般5.57 。动物酶提取过程，影响因素包括破碎程度、pH、温度等，具体操作注意如下：匀浆化前的预处理，冷冻有利于破碎提取物缓冲液的选择(中性)蛋白酶抑制剂的添加保护剂的添加(-巯基乙醇、EDTA、辅酶等 ) 提取液的澄清 ( 高速离心、沉淀、吸附等) 9改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？答：主要方法有：细胞的破碎：1珠磨法。机理：细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂快速搅拌研磨，使其互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放内含物。2高速匀浆法。机理：利用高压是细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。3超声破碎法。机理：细胞在强声波作用下，受到巨大冲击波和剪切力，使细胞胀大破碎。4酶溶法。机理：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。5化学渗透法。机理：某些有机溶剂可以改变细胞膜或壁的通透性使内含物有选择性的渗透出来。6微波加热法。机理：微波加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞壁或膜冲破。沉淀：1、盐析法。机理：一定浓度的中性盐使水分子定向排列，活度大大减少，电解质类物质表面电荷被中和，水膜被破坏，使蛋白质聚集沉淀。2有机溶剂沉淀法。机理：与水互溶的有机溶剂加入到蛋白质等的水溶液中，使其溶解度降低，从而使蛋白质等沉淀下来。3等电点沉淀法。机理：调节溶液pH至蛋白质等两性电解质的等电点，其所带静电荷为零，分子间的吸引力增加，分子相互吸引聚集，使溶解度降低而沉淀下来。4非离子多聚物沉淀法。机理：水溶性非离子多聚物使生物大分子活微粒在单一液相中，由于被排斥相互凝集而沉淀析出。5选择性变性沉淀。机理：有些被分离的生化物质能忍受一些较剧烈的实验条件（温度、PH、有机溶剂），而一些杂志却因不稳定而从溶液中变性沉淀。6生成盐类复合物沉淀。机理：生物大分子和小分子都可以生成某些盐类复合物沉淀，此盐类复合物都具有很低溶解度，极容易沉淀析出。7亲和沉淀。机理：利用蛋白质与特定的生物或合成分子之间的高度专一性作用，将蛋白质“吸附”，形成低溶解度的聚合物。生化分离第三章1、 以静压力差为推动力的膜过滤技术主要有哪些？他们有何特点？答：以静压力差为推动力的膜分离有四种：微滤、超滤、纳滤和反渗透。特点：微滤膜特点： 属于绝对过滤介质; 孔径均匀,过滤精度高,通量大; 厚度薄,吸附量小; 无介质脱落,不产生二次污染; 颗粒容量小,易堵塞。超滤特点：超滤属于压力驱动型膜分离过程，超滤膜的分离范围为相对分子质量500-100万的大分子物质和胶体特质，相对应粒子的直径为0.005-0.1m;分离机理一般认为是机械筛分超滤膜组件有板式、卷式、管式、毛细管式及中空纤维等几种形式过滤的方式一般为错流过滤。纳滤膜的特点：具有纳米级孔径； 操作压力低（一般低于10MPa） ； 可取代传统处理的多个步骤；耐压密性和抗污染能力强；此外带电纳滤膜还能根据离子的大小及电价的高低对低价离子和高价离子进行分离。反渗透膜的特点：(1)所成的膜要有高脱盐率和高通量；(2)要有足够的机械强度；(3)应有良好的化学稳定性，耐水解、耐清洗剂侵蚀、耐强氧化剂杀菌消毒等；(4)耐热性，以便能在较高温度下工作；(5)耐生物降解 (6)耐污染性，可较长期保持膜的性能，少清洗。（反渗透是自己找的）2、 何谓浓差极化现象，怎样避免膜过滤中的浓差极化现象？答：指外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，而大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。减缓措施：一是提高料液的流速，控制料液的流动状态，使其处于紊流状态，让膜面处的液体与主流更好地混合，如搅拌，错流过滤等；二是对膜面不断地进行清洗，消除已形成的凝胶层。3. 何谓膜的污染，发生污染的主要原因是什么？怎样防止和解决污染？膜污染：随操作时间的增加，若膜透过流速迅速下降，溶质的截留率也明显下降原因：1）膜自身的劣化 包括化学性(水解氧化)、物理性(挤压)、生物性(微生物)三种和水生物(附生)污垢 2）水生污垢 由于形成吸着层和堵塞等外因而引起膜性能变化。 防止污染方法：供给液调整+预处理 抗污染膜的开发4、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。种类：据材质分成：1）有机微滤膜 具韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较成熟。常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烃类聚合物组成。 2）无机微滤膜 无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。 3）复合微滤膜复合微滤膜充分利用了有机与无机微滤膜的各自优点 复合微滤膜的制备包括三种形式 1）将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利用层压技术复合在一起；2）通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性；3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR)特点： 属于绝对过滤介质; 孔径均匀,过滤精度高,通量大; 厚度薄,吸附量小; 无介质脱落,不产生二次污染; 颗粒容量小,易堵塞.分离机理：膜的过滤行为与膜及过滤对象的物理化学特性有关。对微滤而言，其分离机理主要是筛分截留液固分离主要作用：(1) 筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。(3) 架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。5、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？考虑的主要参数：截留分子量指截流率达90%以上的最小被截留物质的分子量。（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量，膜截留分子量(MWCO)没有国际通用定义, 需认真分析选择性曲线。流动速率指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。(ml/cm2.min)3. 其它考虑因素还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等。影响流率的主要因素：溶质的分子性质：比重大的纤维分子扩散性差，比重较小的球形分子易扩散溶质浓度：一定压力下，稀溶液比浓溶液流率高；压力：不同溶质应选择不同的操作压力；搅拌：加快溶质分子的扩散，减少浓度极化，从而提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; 温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）;其它：对流率有影响的还有如溶液pH、离子强度及溶剂性质等因素。6、从原理上比较超滤和纳滤两种膜过滤技术，简要说明它们的主要差别。超滤的原理：以特殊超滤膜为分离介质，以膜两侧的压差为推动力，将不同分子量物质选择性分离。纳滤的原理：除按分子大小截留外,纳滤膜表现出建立在离子电荷密度基础上的选择性,对含不同自由离子的溶液,透过膜的离子分布是不相同的(透过率随离子浓度的变化而变化)主要差别：1）超滤是根据分子大小截留，而纳滤除根据分子大小截留外，还会对不同价态离子选择截留。对于极性（或荷电）溶质，其通过纳滤膜时的截留率由静电作用与位阻效应共同决定，而对于非极性溶质则主要取决于位阻效应。2）超滤膜大多为不对称膜，具有不对称微孔结构，纳滤膜大多为荷电膜，可选择截留不同价态离子。3）超滤主要用于分离、提纯和浓缩产品，而纳滤在截留小分子有机物的同时可透析出盐，即集浓缩于透析为一体。7、超滤的工作模式有哪几种，各种工作模式的主要特点是什么。超滤的工作模式有浓缩、透析和纯化特点：（1）浓缩 在浓缩悬浮粒子或大分子的过程中，产物被膜系统截留在料液罐中。溶剂和小分子溶质被出去，料液逐渐浓缩，但通量随着浓缩的进行而降低，故欲使小分子达到一定程度的分离所需时间较长。（2）透析 在浓缩悬浮粒子或大分子的透析过滤中，产物被膜截留住，低相对分子质量溶质（盐、蔗糖和醇）则通过膜，透析过滤可以间歇方式进行，用去离子水或缓冲液反复浓缩和稀释。与浓缩模式相比，透析过滤是在不断加入水或缓冲液的情况下进行的，其加入速度和通量相等，这样可保持较高的通量，但处理的量较大，透过液的体积也大，并且影响操作所需的时间。在实际操作中，常常将两种模式结合起来，即开始用浓缩模式，当达到一定浓度时，转换为透析过滤模式，其转换点应以使整个过程所需时间最短为标准。（3）纯化 采用这一工作模式纯化溶剂和低分子量溶质，他们被回收再透过液流中，可是在截留的物质中也可能同样含有目的产物。8.超-微滤系统的操作方式主要有哪些？各具何特点和各自的适用范围是什么？1）开路式操作料液一次性通过组件，导致透过液的体积非常少，回收率低，除非采用非常大的膜仅适用于浓差极化效应忽略不计和流动速率要求不高的情况下2）间歇式操作截留液需回流入进料罐中，以达到循环的目的，是浓缩一定量物质的最快方法，同样要求膜面积最小。适用于需要连续处理进料液流和其他罐不空的时候3）进料和排放式操作浓缩液一开始全部回流，当回路中的浓度达到最终要求的浓度时，回路中的一部分浓缩液要连续排放，控制料液进入回路的流量等于透过液的流量和浓缩液排放流量之和。在比间歇操作方式还要低的通量下进行4）多级再循环操作最后一级是在最高浓度和最低通量下进行的，而其他各级却都是在较低浓度和较高通量的情况下进行的，总膜面积低于相应的单级操作，接近于间歇操作。通常最少要求3级，710级是比较普遍的。克服了进料-排放式操作时通量低的缺点详见书p54-55第四章生化分离1、色谱分离技术的类型主要有哪些？何谓固定相、流动相、迁移率、分辨率？答： 据固定相基质的形式分类 可分为纸层析、薄层层析和柱层析。 据流动相的形式分类 可分为液相层析和气相层析。 据分离的原理不同分类 可分为吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析等。固定相：是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。他对色谱的效果起关键作用。流动相、迁移率、分辨率等在书本的62页2、羟基磷灰石分离活性物质的主要机理是什么？核算在HA色谱柱上分离的次序是单链RNA，杂链RNA、双链DNA，为什么？答：HA机理的主要观点是：HA的Ca基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，对生物分子的分离起重要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则起次要作用。核酸的洗脱时通过分子中磷酸基与洗脱液中的磷酸根相互竞争来实现的。单链RNA，杂链RNA、双链DNA，与羟基磷灰石的结合越来越强，洗脱时天然DNA 最难被洗脱，其次为杂链RNA，最后为单链RNA。3、 吸附剂的比表面积对吸附容量有何影响？如何克制细颗粒吸附剂流速慢的问题？答：吸附剂的比表面积越大，相应的吸附容量也越大。提高细颗粒吸附剂的抗压性，通过提高其压力来增大流速；可以加入些助滤剂，来提高速度。4、 何谓凝胶过滤外水体积与内水体积？相对分子量为1000和3000的一组分子，或相对分子质量为8万和10万的一组分子能否在sephadexG-75柱中分开？为什么？答：不能分开，sephadexG-75柱的分离范围为3000-80000，所以在此分离系统中，前两种物质都为c类分子，后两种为a类分子。均不能进行有效分离。5、伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子质量能否一起用葡聚糖凝胶层析柱测定？为什么？ 不能。凝胶过滤色谱法测定分子量时，首先要讲几种已知分子量的物质加样至色谱柱，分别测出洗脱体积Ve，同时计算出这些分子相应的lgMr值，并以Ve对lgMr作图，得到该色谱柱的分子量标准曲线，然后在相同条件下对需要测定分子量的物质进行色谱，测出其Ve值，再根据标准曲线求出该物质的分子量。但是，凝胶过滤色谱时溶质的洗脱体积不仅与分子量有关，还与分子形状密切相关，具有相同分子量的球状分子和纤维状分子在洗脱性质上差异很大。因此，在做标准曲线时，选用的分子量标准应当与所测目标分子有着相似的形状。由于伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子形状相差很大，因此需选用不同形状的已知分子做标准曲线，分别测定他们的分子量，不能一起用葡聚糖凝胶层析柱测定。6A7、层析系统的分辨率主要取决于什么参数，何种最重要？一个纯化协同能够达到的分辨率取决于改系统的选择性、效率和容量。其中离子交换剂是离子交换层析的基础，决定着分离过程的分辨率等，是最关键的因素。提高RS以达满意分离效果，须满足以下条件：（1）1（当VR1VR2时1，两峰完全重叠，分辨率为0），的值越大，两峰相距越远，分辨率越高；（2）N尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高；（3）k0，若k0，无法实现分离，分辨率为0，需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k 0，增加k的值将提高分辨率RS，有利于分离。 8、疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有何区别？为什么？疏水作用层析：固定相为适度疏水性的填料，基质一般为高度亲水性，其疏水配基主要是烷基和芳香基。流动相为含盐的水溶液，流动性条件对HIC的影响主要表现在所用盐的种类和浓度、流动相的PH，以及其他添加剂的影响。普通的吸附层析：固定相由水不溶性基质和共价结合在基质上的配基组成。主要原因是原理的不同9、利用疏水作用色谱分离A和B的混合物是，在某操作条件下A和B的分离度不理想。是分析如何改善操作条件。或如何选择色谱柱。操作条件的改善：1根据AB的疏水性强弱，可以改变其实缓冲液的盐浓度，使A和B以不同的结合力度结合到层析住上。流动相盐浓度的大小直接决定了分离物质与色谱介质之间的疏水作用的强弱。P1552优化色谱过程中的PH，即分别在不同的PH的流动相条件下进行色谱分离，确定分离过程的最佳PH。流动相A的PH直接影响目标分子在色谱介质上的结合强度及分离过程的选择性。3、优化洗脱模式。先用简单的线性的梯度洗脱后对洗脱条件进行优化后采用符合梯度；或是先用简单的梯度斜率，后在出峰位置适当的降低盐浓度或是增加盐浓度得到更好的分辨率。P1574、控制操作温度。P158层析介质的改善：根据疏水性的不同选择疏水性不同的层析介质。P15710.请从原理、填料、应用范围几方面比较反相层析与疏水层析的主要差异。答：P151原理:都为利用溶质分子疏水性差异从而与固定相间疏水相互作用强弱不同而实现分离的层析技术，由于填料疏水差异洗脱流动相有差异：疏水作用层析流动相：含盐水溶液；反相层析流动相：水和有机溶剂（降低介电常数，降低疏水作用，增强洗脱能力）构成。11.试解释线性梯度洗脱的反相层析中溶质得到浓缩的机理。 答：（没找到答案，个人理解）反相层析中，线性梯度洗脱一般是连续增加有机溶剂比例的，这就是说溶质的洗脱推动力（速度）是不断增大的，由于溶质的洗脱是需要一定时间内完成，后洗脱部分就会赶上先洗脱部分，实现浓缩，但是带来的缺点是分离度的降低（可以的话可仅在目的物出峰部位采用，即混合梯度）12、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。答：亲和层析的特异性洗脱是指使用配体（如：用不同的核苷酸将脱氨酶从染料柱上洗脱）或者使用能与配体结合的分子（如：用游离糖将糖蛋白从凝集素柱上洗脱）将目的物从亲和层析柱上洗脱下来。优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后需要进一步分离亲和层析的非特异性洗脱是指通过以下方式洗脱，得到目的物：1、改变缓冲液的离子强度。配体与目标分子间如果是离子作用则升高离子强度；如果是疏水作用则降低离子强度 离子强度变化方式可以是阶段式和梯度式2、改变缓冲液的pH值 ，改变表面带电基团的电性和电量，从而破坏离子键 阶段式为主 3、改变缓冲液的极性 配体和目标分子依靠较强的疏水作用结合时，可以往洗脱液中添加一定比例的有机溶剂4、使用洗涤剂 极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白 最好使用在280nm附近无吸收的非离子型洗涤剂，如NP-40, Lubrol 5使用促溶盐（chaotropic salt）促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏水作用的强度6、使用蛋白质变性剂 （如8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍）优点：价格便宜，配体不与目标分子结合，目标分子能够直接分离。 缺点：需要在操作中改变洗脱条件或者添加别的物质，洗脱条件不温和，易使目标分子变性。13、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“手臂”？答：在载体和配基之间引入适当长度的“手臂”，可以减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。书P11314、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。主要方法：P114-P118步骤：P113最后一段P114第二段。15. 亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围。答：亲和层析的特殊类型有共价色谱、金属螯合色谱、有机染料亲和色谱、凝集素亲和层析、免疫亲和色谱等。书P122-130一、共价色谱原理：利用形成和破坏共价键能力的差异分离其共价键常为二硫键S-S应用范围：主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽二、金属螯合色谱原理：His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。或者：蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物。 应用范围： 含组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环的蛋白质分子。有机染料亲和色谱 三、 有机染料亲和色谱原理：有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。应用范围：常用的染料有Cibacron blue F3GA（多芳香环的磺化物）和Procion Red HE3B，多以Sepharose作为载体，前者称蓝色Sepharose，后者称红色Sepharose。蓝色染料Cibacron blue F3GA在结构上与NAD+和NADP+很相似，用于纯化NAD+、NADP+依赖性酶，如各种激酶、磷酸酶、脱氢酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等。红色染料Procion Red HE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纤蛋白溶酶原等，结合不仅依赖于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用。四、凝集素亲和层析原理：凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合，不同的凝集素结合不同的糖分子。应用范围：用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等五、免疫亲和色谱原理：P124应用范围：抗体抗原16、用色谱聚焦分离出的样品液，要增加除去洗脱液的操作，为什么在其他色谱方法中提到这点？答：在色谱聚焦中，用于洗脱样品的是一种多组分缓冲剂。多组分缓冲剂是两性电解质性缓冲剂，由相对分子量大小不一的多种组分构成，每种构成成分均为多羧基多氨基化合物，存在各自的等电点。洗脱液的pH 多接近于目的物的等电点，如果长时间将目的物在洗脱液中，目的物（如蛋白质分子）很容易发生沉淀，因此应及时去除洗脱液。而在其他操作中的洗脱剂不是由两性电解质构成，不会使目的物蛋白质发生沉淀，所以未提及去除缓冲剂。第五章生化分离1.何谓电泳迁移率？进行凝胶电泳时蛋白质的电泳迁移率由哪些因素决定的？电泳迁移率即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。迁移率与球形分子的半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关：2 简述聚丙烯酰胺聚合的主要方法和特点，并说明影响聚合的主要因素?P1703.一次天然PAGE是否直接测定蛋白质的分子量？为什么？怎样通过实验设计利用天然PAGE测定蛋白质分子量。不能。天然的不仅与分子量有关，还与蛋白的电荷密度、形状等有关。方法：先用不同浓度的凝胶同时测量未知和已知分子量的蛋白质的相对迁移率；对不同蛋白质分子，以其相对迁移率的对数对凝胶浓度作图，直线的斜率为阻滞系数；用已知分子量的蛋白质的阻滞系数对它们的分子量作图，得到一条直线，在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量。 4.请比较天然PAGE ,SDS-PAGE 及IEF原理和应用上的区别P173、P180、P1845.不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的原理是基于哪几种效应，其原理是什么，分析不连续系统相对分辨率较高的原因。P1746.某一已纯化的蛋白无SDS的凝胶电泳图如下图所示，两种情况下的电极槽缓冲液pH都为8.2。根据下面两幅图给出的信息，有关该纯化蛋白的结构你能得出什么结论？该蛋白的pI是大于还是小于8.2？答：该蛋白是由两个大小不同的亚基组成的球形蛋白质，在pH8.2的条件下，带负电荷，因此，该蛋白pI的小于8.2。7.等电聚焦IEF的主要原理是什么？为什么等电聚焦过程一般都采用高电压、恒功率方式？答：等电聚焦的原理：在一种特殊的两性电解质两端施加直流电场，可形成线性的pH梯度。利用蛋白质的pI差别，可在其上不同处聚焦分离。等电聚焦时，随样品迁移，电流会越来越小，功率是电压和电流的乘积，所以为加快分离，提高分辨率, 电压应是越高越好，但须避免烧胶（受胶的厚薄、电泳的冷却系统、载体两性电解质的导电性和pH、凝胶介质及样品的质量、加速剂的用量等因素影响）。8.说明SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理，电泳前样品需怎样处理？为什么？答：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理见课本P180。电泳前样品处理方法及原因见课本P182-183。9.梯度电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳都是按分子量大小不同进行分离的电泳方法，比较这两种方法在原理和应用主要差异。答：梯度电泳原理：利用梯度混合器使胶的孔径呈梯度变化，分子量不同的Pr所能到达的前沿不同。特点：分辨率提高且能浓缩、分离范围大 5200万MW Gel浓430%、亚基不分离，得到天然蛋白质分子量、只适用于球蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理见课本P180，该电泳方法主要用于分析样品组分、监测蛋白质纯化过程、并进行定性、定量，特别是可测定蛋白质的亚基分子量。10.何谓双向电泳？说明双向电泳操作的主要步骤。样品的前处理主要有哪些方法？答：双向电泳的定义：采用两种不同原理的电泳程序（一般第一向为等电聚焦，第二相为SDS电泳，可使分辨率提高几个数量级，并可同时得到等电点和分子量等信息。双向电泳是当前蛋白质组分析的关键开门技术。主要步骤包括：样品制备、等电聚焦、缓冲液置换、梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、检测、蛋白质图谱分析。样品处理方法见课本P193。11.请归纳凝胶电泳技术中检测条带的 染色方法和特点，分析条带变形的主要原因。答：(1)考马斯亮蓝染色，分为R-250和G-250，常用R-250。染色后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系，在一定pH值时，蛋白质-染料复合物又可解聚染色灵敏度达0.20.5g/带。(2)银染色，先固定，蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上而显色显色有化学显色和光显色灵敏度达2ng/带。(3)其他染色方法荧光染料法、苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿FCF，蛋白质与2,4-DNFB的反应等等。条带变形主要有以下几种：“微笑”现象常在厚胶和垂直电泳中出现，原因：凝胶中间冷却不均匀；“皱眉”原因 （垂直电泳中可能出现）电泳装置不合适，靠近隔板处凝胶未聚合完全或凝胶底部有气泡。“脱尾”现象原因：样品溶解不佳，凝胶浓度过高克服：加样前离心，选合适缓冲液，加增溶辅助试剂，降低凝胶浓度。“纹理”现象原因：常常是样品中不溶颗粒造成的克服：增加溶解度，离心除不溶颗粒。生化分离第六章1、 低速、中速、高速离心机是如何划分的？主要应用范围？一般如何表示转速？ 低速离心机：转速8000 r/min以下（最大相对离心力10000g以下），用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等 高速离心机：转速1000025000 r/min（10000100000g），用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大细胞器等 超速离心机：25000150000 r/min（1000001000000g），其中制备型超速离心机用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化；分析型用于样品纯度检测、沉降系数和分子质量的测定一般低速离心通常以转子每分钟的转速表示（r/min）; 而较高速度离心时，往往用相对离心力来表示(g)。2、 超速离心机由哪几部分构成？其制备型和分析型在配置和应用上有何差异？由驱动系统、真空系统、恒温系统、控制系统、润滑系统等组成。配置：制备型上常用角式转子、甩出吊桶式转子、垂直转子、区带转子，有些还配备可以大容量离心的连续流转子，分析型则使用专门的分析转子。较为先进的制备型离心机还可选配附属设备，如分析光学附件、密度梯度形成-收集器、切管器等。分析型离心机可认为是一台制备型超速离心机和一套在样品沉降过程中能直接测定离心池中样品浓度的光学系统的结合体。离心机中装有柱面透镜、紫外可见光或干涉光等光学检测系统进行沉降系数、分子质量、扩散系数等测定和诸如颗粒形状和结构的分析，数据的处理由计算机完成。应用：制备型超速离心机用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化。分析型用于样品纯度检测、沉降系数和分子质量的测定，主要为了研究生物大分子物质的沉降特性和结构，使用特殊设计的分析转子和检测系统，连续的监测物质在离心力场中的沉降过程。3、 转子有哪些种类？各有何特点和各自的使用分离范围是什么？角式转子、甩出吊桶式转子（水平转子）、垂直转子、区带转子、连续流转子，分析转子。角式转子：基本转子，转速最高，管孔中心线和旋转轴夹角通常为1545，强度高、重心低、运转平稳、使用方便、寿命长。对于分离沉降特性差异较大的颗粒效果较好，常用于差速离心。甩出吊桶式转子（水平转子）：在转子体上悬吊着36个自由活动的吊桶，装样品的离心管安放于吊桶内，加速过程中离心管中心线逐渐与旋转中心线垂直，即被甩到水平位置；离心时间较长。主要用于密度梯度区带离心垂直转子：离心管垂直放置；样品沉降行程特别短，由碰撞和温差引起的对流不显著。同样离心速度下，离心所需时间比角式转子和水平转子短；加工用料多、价格贵、密封要求高。可用于差速离心和区带离心区带转子：高速区带转子一般用铝合金制造，超速区带转子一般用钛合金制造。样品槽用十字形隔板隔趁4个扇形室，隔板中心加工有导管，离心室上部安装有防护支撑板。转子耐腐蚀要求高。用于差速离心连续流转子：形状类似于区带转子，中心部分差别较大。用于超速离心机上的连续流转子适用于从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中收集细胞、纯化病毒等，最大额定转速3200035000rpm；用于高速离心机上的连续流转子最适合培养液浓缩，用以收集菌体或其他沉降物，最大额定转速20000rpm以下。分析转子：有数个装离心池的小室，配以多种离心池，离心池可以上下透光。转速1800072000rpm4、 离心管在离心时除要考虑以旋转心中对称放置、质量相等外，还应考虑什么？为什么？容量、强度、转速、耐热耐腐蚀性、离心介质。由于离心管材质不同，能承受的应力就有很大不同，使用时不能超过离心管所能承受的最大转速，否则离心管要变形开裂5、请比较凝胶过滤分离的机理及主要操作条件与离子交换色谱有何异同点。答：机理：凝胶过滤分离：不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同，凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了色谱分离时该溶质在色谱柱中的保留时间，不同物质因保留时间不同而分离。离子交换色谱：待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由强到弱的顺序被洗脱下来而得以分离。 主要操作条件：凝胶过滤分离：1凝胶过滤色谱介质的选择；2色谱柱的尺寸；3洗脱剂体积。离子交换色谱：1离子交换剂的选择；2色谱柱的尺寸；3起始缓冲液的种类；4pH和离子强度；5洗脱缓冲液的pH和离子强度等。6、对已知沉降系数和未知沉降系数的组合，如何判断其离心时间（P223-224）答： 1、若沉降系数S已知，有公式： 括号中的部分可用转子的效率因子K表示，它与转子的半径和转速有关。 2、3、如果颗粒接近圆球状，但不知沉降系数，也可借助于有关参数，由公式6.14和6.17得到沉降时间：T=。参见P224，公式6.24。7、何谓差速离心法、密度梯度区带离心法？后者又可分为哪两种类型？简述他们的分离原理和应用范围（P225-227）答：差速离心法：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。此法适用于沉降系数差别较大的组分之间的分离，主要用来分离培养液、细胞器和病毒等。密度梯度区带离心法：样品在密度梯度分布的惰性介质中以一定的离心力进行离心沉降或离心平衡，把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此方法用于分离沉降系数或密度差异较小的组分，并可获得较高的纯度。 密度梯度区带离心法分为：（1）差速-区带离心法，它是一种沉降速率法，当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定速率沉降，在密度梯度不同的区域上形成区带的方法。该方法适用于分离有一定沉降系数差的颗粒。大小相同、密度不同颗粒不能用该方法分离。（2）等密度离心法，（P227）是一种沉降平衡法。当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到他们密度恰好相等的位置上（即等密度点，=）形成区带。它的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，时间和区带的密度。此方法常用来分离大小相似而密度有差异的颗粒。由于大多数蛋白质有相似的密度，所以通常不用这种方法分离蛋白质，但利用含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上有明显区别，可以用等密度离心法将它们分离。8、简述泡沫分离技术的原理、特点和主要应用范围P233答：原理：泡沫分离过程是利用待分离物质本身具有表面活性（或表面活性剂）或能与表面活性剂通过化学的、物理的力结合在一起（如金属离子、有机化合物、蛋白质和酶等），在鼓泡塔中被吸附在气泡表面，得以富集，借气泡上升带出溶剂主体，达到净化主体液、浓缩贷分离物质的目的。特点：它的分离作用主要取决于组分在气-液界面上吸附的选择性和程度，其本质是各种物质在溶液中表面活性的差异。主要应用范围：（P233，见四、泡沫分离的应用）两大类：一类是本身为非表面活性剂，可