微生物学 第七章 微生物的生长与控制.ppt

第七章微生物的生长与控制 一个微生物细胞 合适的外界条件 吸收营养物质 进行代谢 如果同化作用的速度超过了异化作用 个体的生长原生质的总量 重量 体积 大小 就不断增加 如果各细胞组分是按恰当的比例增长时 则达到一定程度后就会发生繁殖 引起个体数目的增加 群体内各个个体的进一步生长 群体的生长 生长 微生物细胞吸收营养物质 进行新陈代谢 当同化作用 异化作用时 生命个体的重量和体积不断增大的过程 繁殖 生命个体生长到一定阶段 通过特定方式产生新的生命个体 即引起生命个体数量增加的生物学过程 发育 从生长到繁殖 是生物的构造和机能从简单到复杂 从量变到质变的发展变化过程 这一过程称为发育 生长与繁殖的概念 个体生长 微生物细胞个体吸收营养物质 进行新陈代谢 原生质与细胞组分的增加为个体生长 群体生长 群体中个体数目的增加 可以用重量 体积 密度或浓度来衡量 由于微生物的个体极小 所以常用群体生长来反映个体生长的状况 个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长 个体繁殖 Contents 第一节测定微生物生长繁殖的方 1 第二节微生物的生长规律 2 第三节影响微生物生长的主要因 3 第四节微生物培养法 4 第五节有害微生物的控制 1 纯培养 pureculture 微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代 称纯培养 描述不同种类 不同生长状态的微生物生长情况 需选用不同的测定指标 第一节测定微生物生长繁殖的方法 微生物纯培养生长的测定方法 一 测生长量直接法 干重法 测体积法 间接法 比浊法 碳 氮含量法 其它生理指标 二 计繁殖数直接法 死 活细胞总数 血球计数板 比例计数法间接法 活菌 平板菌落计数法 液体稀释法 膜过滤法 一 测生长量 微生物生长量和生理指标测定法 1 直接法 1 粗放的测体积法 2 精确的称干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来 然后烘干 干燥温度可采用105 100 或80 称重 一般干重为湿重的10 20 而一个细菌细胞一般重约10 12 10 13g 该法适合菌浓较高的样品 例 大肠杆菌一个细胞一般重约10 12 10 13g 100ml培养物若得10 90mg干重的细胞 则液体培养物中细胞浓度达到2 109个 ml 2 间接法 1 比浊法借助于分光光度计 在一定波长下测定菌悬液的光密度 就可反应出菌液的浓度 原理 在一定范围内 菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比 即与光密度成正比 菌数越多 光密度越大 特点 快速 简便 引自周德庆 2003 2 生理指标法 测含氮量蛋白质是细胞的主要物质 含量稳定 而氮是蛋白质的主要成分 通过测含氮量就可推知微生物的浓度 一般细菌含氮量为干重的12 5 酵母菌为7 5 霉菌为6 0 根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6 25 就可测得粗蛋白的含量 N 6 25 Pr其他方法含碳 磷 DNA RNA 耗氧量 消耗底物量 产CO2 产酸 产热 粘度等 都可用于生长量的测定 血球计数板法 死 活细胞在内的总菌数 二 计繁殖数 单细胞微生物细胞数目的检测法 一 直接法 如用特殊染料对菌体进行染色后 再用光学显微镜计数 可作活菌计数和总菌计数 引自沈萍 2003 二 间接法 活菌计数法 1 平板菌落计数法 菌落形成单位 colonyformingunit cfu 一定菌样中的单个微生物经培养后 形成的单菌落 根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度即可推算出菌样的含菌数 2 厌氧菌的菌落计数法 亨盖特滚管培养法 半固体深层琼脂法 第二节微生物的生长规律 一 微生物的个体生长和同步生长二 单细胞微生物的典型生长曲线三 微生物的连续培养四 微生物的高密度培养 由于微生物细胞极其微小 研究其个体生长存在着技术上的困难 用电子显微镜和同步培养技术 同步生长 synchronousgrowth 一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态 称为同步生长 同步培养技术 获得同步生长的技术 同步细胞 进行同步分裂的细胞称为同步细胞 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相 彼此间形态 生化特征都很一致 因而是细胞学 生理学和生物化学等研究的良好材料 一 微生物的个体生长和同步生长 获得同步生长的方法 获得同步生长的方法主要有两类 环境条件诱导法 抗生素 变换温度 光线 培养基等 造成与正常细胞周期不同的周期变化 机械筛选法 选择性过滤 梯度离心或膜洗脱法 物理方法 随机选择 不影响细胞代谢 硝酸纤维素膜法 原理 一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤维微孔滤膜上 步骤 菌悬液通过微孔滤膜 细胞吸附其上 反置滤膜 以新鲜培养液通过滤膜 洗掉浮游细胞 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞 即为同步培养 这种细胞在培养过程中 一般经2 3个分裂周期就会丧失其同步性 二 单细胞微生物的典型生长曲线 生长曲线 定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线 单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代 一个世代所需的时间就是代时 enerationtime G 代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间 有时也称为倍增时间 生长速率常数 每小时分裂次数 用R表示 右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况 如图可见 每经过一个代时 细胞数目就增加一倍 呈指数增加 因而被称为指数生长 这就是单细胞群体生长的特征 即 X2 X1 2n 将少量单细胞的纯培养 接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中 在适宜条件下培养 每隔一定时间取样 测菌细胞数目 以培养时间为横坐标 以细菌增长数目的对数为纵坐标 绘制所得的曲线 生长曲线的制作 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律 其结论也基本适用于酵母菌 生长曲线代表了单细胞微生物在新的环境中从开始生长 分裂直至死亡的整个动态变化过程 每种单细胞微生物都有各自的典型生长曲线 但它们的生长过程却有着共同的规律性 一般可以将生长曲线划分为四个时期 典型生长曲线 Growthcurve 延滞期 对数期 稳定期 衰亡期 时期的划分 按照生长速率常数R growthraceconstant 的不同 又称 停滞期 调整期 适应期1 现象 活菌数没增加 曲线平行于横轴 2 特点 生长速率常数R 0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高 原生质嗜碱性增强合成代谢活跃 核糖体 酶类 ATP合成加快 易产生诱导酶对外界不良条件敏感 如氯化钠浓度 温度 抗生素等化学药物 3 原因 适应新的环境条件 合成新的酶 积累必要的中间产物 一 延滞期 lagphase 认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义 在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期 措施有 接种龄 采用对数生长期的健壮菌种 增加接种量 一般来说 接种量增大可缩短甚至消除延迟期 发酵工业上一般采用1 10的接种量 调整培养基的成分 应适当丰富 且发酵培养基成分尽量与种子培养基的成分接近 二 对数期 logarithmicphase 指数期 在生长曲线中 紧接着延滞期的一段细胞数目以几何级数增长的时期 其对数与时间呈直线关系 1 指数期的特点 生长速率常数R最大 即代时最短 细胞进行平衡生长 菌体大小 形态 生理特征等比较一致 酶系活跃 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感 2 指数期中的的三个重要参数 繁殖代数 n 指数生长方式 1 2 4 8 2n设接种时细胞数为x1 时间为t1 到时间t2后 繁殖n代 细胞数为x2 它们之间的相互关系为 x2 x1 2n以对数表示 x2 x1 n 2 n 3 322 x2 x1 x2 x1 2 x2 x1 t2 t1 培养时间 Lg细胞数 ml 繁殖代数n 3 322 lgx2 lgx1 代时在不同种微生物中的变化很大 多数微生物的代时为1 3h 然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min 而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天 另外 同一种微生物 在不同的生长条件下其代时的长短也不同 但是 在一定条件下 每一种微生物的代时是恒定的 因此它是微生物菌种的一个重要特征 一些细菌的代时 菌名培养基培养温度代时E coli 大肠杆菌 肉汤37 17minE coli牛奶3712 5Enterobacteraerogenes 产气肠细菌 肉汤或牛奶3716 18E aerogenes组合3729 44B Cereus 蜡状芽孢杆菌 肉汤3018B thermophilus 嗜热芽孢杆菌 肉汤5518 3Lactobacillusacidophilus 嗜酸乳杆菌 牛奶3766 87Streptococcuslactis 乳酸链球菌 牛奶3726S lactis乳糖肉汤3748Azotobacterchroococcum 褐球固氮菌 葡萄糖25344 46Mycobacteriumtuberculosis 结核分枝杆菌 组合37792 93Nitrobacteragilis 活跃硝化杆菌 组合271200 3 影响指数期微生物代时长短的因素 1 菌种 不同菌种其代时差别极大 2 营养成分 同一种微生物 在营养丰富的培养基上生长时 其代时较短 反之则长 3 营养物浓度 既影响微生物的生长速率 又影响它的生长总量 浓度0 1 2 0mg mL影响生长速率 浓度2 0 8 0mg mL时影响最终产量 4 培养温度 温度对微生物的生长速率明显的影响 营养物浓度与对数期生长速率和产量 作用方式 影响微生物的生长速率和总生长量 生长限制因子 凡是处于较低浓度范围内 可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子 8 0mg ml6 0mg ml4 0mg ml2 0mg ml1 0mg ml0 5mg ml0 2mg ml0 1mg ml 只最大收获量受影响 生长速度和最大收获量受影响 时间 细胞数或菌体量 应用意义 指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致 细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点 是 1 用作代谢 生理等研究的良好材料 2 是增殖噬菌体的最适宿主 3 是发酵工业中用种子的最佳材料 4 进行染色 形态观察等的良好材料 三 稳定期 stationaryphase 恒定期 最高生长期 1 特点 1 R 0 即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等 或正生长与负生长相等的动态平衡之中 培养物中的细胞数目达到最高值 2 菌体产量达到了最高点 引自周德庆 2003 3 菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系 可用生长产量常数Y 生长得率来表示 表示微生物对基质利用效率的高低 Y 菌体干重 消耗营养物质的浓度根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量意义 消耗每g或mol营养物质所产生的菌体干重 g 4 细胞内开始积聚糖原 异染颗粒和脂肪等内含物 5 芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢 6 通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物 稳定期产物 2 稳定期到来的原因 1 营养物尤其是生长是限制因子耗尽 2 营养物的比例失调 3 酸 醇 毒素或H2O2等有害代谢产物的累积 4 pH 氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜 等等 3 生产实践的重要指导意义 1 对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期 2 是对维生素 碱基 氨基酸等物质进行生物测定的最佳测定时期 3 通过对稳定期到来原因的研究 促进了连续培养原理的提出和工艺 技术的创建 四 衰亡期 declinephase 1 特点 1 细胞死亡数增加 死亡数大大超过新增殖的细胞数 群体中的活菌数目急剧下降 出现 负生长 R 0 2 细胞内颗粒更明显 细胞出现多形态 畸形或衰退形 3 因菌体本身产生的水解酶及代谢产物的作用 使菌体死亡 自溶等 发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势 4 有的微生物合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢 5 芽孢杆菌在此期释放芽孢 等等 衰亡期比其他各时期时间长 它的长短也与菌种和环境条件有关 2 产生原因 生长条件的进一步恶化 使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢 继而导致菌体的死亡 丝状微生物的群体生长 丝状微生物的纯培养采用孢子接种 在液体培养基中振荡培养或深层通气加搅拌培养 菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构 以菌丝干重作为衡量生长的指标 即以时间为横坐标 以菌丝干重为纵坐标 绘制生长曲线 培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系 可分为三个阶段 1 停滞期 生长延滞期 2 迅速生长期 快速生长期 3 衰亡期 生长衰退期 1 生长停滞期 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态 另一种是生长已经开始 但还无法测定 2 迅速生长期 菌丝体干重迅速增加 其立方根与时间呈直线关系 菌丝干重不以几何级数增加 没有对数生长期 生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支 断裂等 此时期的菌体呼吸强度达到高峰 有的开始积累代谢产物 3 衰退期 菌丝体干重下降 到一定时期不再变化 大多数次级代谢产物在此期合成 大多数细胞都出现大的空泡 有些菌丝体还会发生自溶菌丝体 这与菌种和培养条件有关 丝状微生物的群体生长 三 微生物的连续培养 continuousculture 分批培养 batchculture 将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养 培养基一次性加入 不再补充和更换 最后一次性收获 连续培养 continuousculture 在微生物培养的过程中 不断地供给新鲜的营养物质 同时排除含菌体及代谢产物的发酵液 让培养的微生物长时间地处于对数生长期 以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态 连续培养理论基础 由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识 采取相应有效措施推迟其来临 从而发展出现在的连续培养技术 当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌 另一方面以溢流方式流出培养液 使培养物达到动态平衡 其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率 一 连续培养原理 连续培养器 按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分 内控制 控制菌体密度 恒浊器外控制 控制培养液流速 以控制生长速率 恒化器 单级连续培养器多级连续培养器 一般连续培养器固定化细胞连续培养器 实验室科研用 连续培养器发酵生产用 连续发酵罐 二 连续培养器 三 连续培养技术 1 恒化连续培养概念 以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持微生物始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养 原理 通过控制某一种营养物浓度 如碳 氮源 生长因子等 使其始终成为生长限制因子 而达到控制培养液流速保持不变 并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖 特点 维持营养成分的亚适量 控制微生物生长速率 菌体生长速率恒定 菌体均一 密度稳定 产量低于最高菌体产量 应用范围 实验室科学研究 恒化器 Chemostat或bactogen 引自周德庆 2003 概念 根据培养器内微生物的生长密度 借光电控制系统来控制培养液流速 以取得菌体高密度 生长速度恒定的微生物细胞 原理 通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌液浓度不变 即浊度不变 当浊度高时 使新鲜培养基的流速加快 浊度降低 则减慢培养基的流速 特点 基质过量 微生物始终以最高速率进行生长 并可在允许范围内控制不同的菌体密度 但工艺复杂 烦琐 2 恒浊培养 使用范围 用于生产大量菌体 生产与菌体生长相平行的某些代谢产物 如乳酸 乙醇等 引自周德庆 2003 恒浊器与恒化器的比较 四 连续发酵 continuousfermentation 将连续培养用于发酵 即为连续发酵 相对于单批发酵而言 SCP的生产 乙醇 乳酸 丙酮和丁醇的发酵 石油脱蜡 污水处理等应用 优点 高效 简化了操作装料 灭菌 出料 清洗发酵罐等单元操作 自控 便于利用各种仪表进行自动控制 产品质量稳定 节约大量动力 人力 水和蒸汽 且使水 汽 电的负荷均衡合理 缺点 菌种易于退化 易于遭到杂菌污染 营养物利用率低于单批培养 连续发酵的生产时间受以上因素限制 一般只能维持数月 1年 指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术 现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物 选取最佳培养基成分和各成分含量 补料 采用逐量流加的方式进行 提高溶解氧的浓度 防止有害代谢产物的生成 四 微生物的高密度培养 高密度发酵 高密度培养的具体方法 应用 用基因工程菌生产多肽类贵重药物 胰岛素 白细胞介素 干扰素 生长激素等 不同菌种和同种不同菌株间 达到高密度的水平差别很大 E coli可达174 175g 湿重 L 理论值可达200g L 甚至400g L 目前被用于高密度培养的只有大肠杆菌和酿酒酵母 第三节影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的外界因素很多 除了营养因素之外 还有许多物理化学因素 如 O2 温度 pH值 水活度 渗透压 Eh 辐射 UV 电离辐射 超声波 化学药剂等 本节主要内容 一 温度对微生物生长的影响二 氧气对微生物生长的影响三 pH值对微生物生长的影响 温度是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一 温度对微生物的影响具体表现在直接影响细胞内的各种生化反应 影响酶活性 温度变化影响酶促反应速率 最终影响细胞合成 影响细胞膜的流动性 温度高 流动性大 有利于物质的运输 温度低 流动性降低 不利于物质运输 因此 温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌 影响物质的溶解度 对生长有影响 一 温度对微生物生长的影响 从微生物整体来看 生长的温度范围一般在 10 100 极端下限为 30 极端上限为105 300 但对于特定的某一种微生物 只能在一定温度范围内生长 宽温微生物 窄温微生物 在这个范围内 每种微生物都有自己的生长温度三基点 即最低 最适 最高生长温度 最适生长温度 某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度 处于最适生长温度时 生长速度最快 代时最短 超过最低生长温度时 微生物不生长 温度过低 甚至会死亡 超过最高生长温度时 微生物不生长 温度过高 甚至会死亡 一 微生物生长温度的三基点 根据微生物的最适生长温度的不同 可将微生物划为三个类型 二 微生物生长温度类型 低温型微生物 嗜冷微生物 20 一般为15 中温型微生物 嗜温微生物 20 45 室温菌约25 体温菌约37 高温型微生物 嗜热微生物 45 一般50 60 低温型微生物 最适生长温度在5 20 主要分布在地球的两极 冷泉 深海 冷冻场所及冷藏食品中 中温型微生物 最适生长温度为20 40 大多数微生物属于此类 室温型主要为腐生或植物寄生 在植物或土壤中 体温型主要为寄生 在人和动物体内 高温型微生物 最适生长温度为50 60 主要分布在温泉 堆肥和土壤中 菌名生长温度发酵温度累积产物温度 Streptococcusthermophilus374737S lactis3440产细胞 25 30产乳酸 30Streptomycesgriseus3728 Corenybacteriumpekinense3233 35 Clostridiumacetobutylicum3733 Peniciliumchrysogenum302520以青霉素的生产为例 培养165小时采用分段控制温度的方法 其青霉素产量比始终在30 培养提高了14 7 分段控制方式 0 5小时 30 5 40小时 25 40 125小时 20 125 165小时 25 不同生理生化过程的最适温度 微生物不同生理活动要求不同温度最适生长温度 发酵速度快 积累代谢产物多 1 高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性 膜受热出现小孔 破坏细胞结构 溶菌 微生物对热的耐受力与以下因素有关 1 微生物种类及发育阶段嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热 三 高温与低温对微生物的影响 2 微生物对热的耐受力还受环境条件的影响与培养基的营养成分有关 培养基中蛋白质含量高时比较耐热 与pH有关 pH适宜时不易死亡 pH不适宜时 容易死亡 与水分有关 含水量大时容易死亡 含水量小时不容易死亡 与含菌量有关 含菌量高 抗热性增强 含菌量低 抗热性差 与热处理时间有关 热处理时间长 微生物易死亡 当环境温度低于微生物的最适生长温度时 微生物的生长繁殖停止 当微生物的原生质结构并未破坏时 不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力 当温度提高时 可以恢复正常的生命活动 低温保藏菌种就是利用这个原理 一些细菌 酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4 的冰箱中 当温度过低 造成微生物细胞冻结时 有的微生物会死亡 有些则并不死亡 2 低温对微生物的影响 造成死亡的原因 冻结时细胞水分变成冰晶 冰晶对细胞膜产生机械损伤 膜内物质外漏 冻结过程造成细胞脱水 冻结速度对冰晶形成有很大影响 缓慢冻结 形成的冰晶大 对细胞损伤大 快速冻结 形成的冰晶小 分布均匀 对细胞的损伤小 因此 利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏 一般情况下在菌悬液中再加一些甘油 糖 牛奶 保护剂等可对菌种进行长期保藏 氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响 微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大 根据微生物与氧的关系 可把它们分为几种类群 专性好氧菌好氧菌微好氧菌兼性厌氧菌耐氧厌氧菌厌氧菌 专性 厌氧菌 二 氧气对微生物生长的影响 五类与氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态 模式图 引自周德庆 2003 氧浓度对不同微生物生长的影响 引自周德庆 2003 严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死 而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡 在氧还原为水的过程中 可形成某些有毒的中间产物 例如 过氧化氢 H2O2 超氧阴离子 O2 等 超氧阴离子为活性氧 兼有分子和离子的性质 反应力极强 极不稳定 可破坏膜和重要生物大分子 对微生物造成毒害或致死 好氧微生物具有降解这些产物的酶 如过氧化氢酶 过氧化物酶 超氧化物歧化酶等 而严格厌氧菌缺乏SOD 故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死 厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说 H2O O22O2 2H O2 H2O22H2O O2 eO2 O2 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成 超氧物阴离子歧化酶 SOD 是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式 兼性厌氧菌E coli在发生SOD缺失突变后 就会变成一种 严格厌氧菌 生物体中超氧阴离子的形成与去除 12 SOD好氧生物和耐氧细菌 过氧化氢酶好氧生物 过氧化物酶NADH2NAD耐氧菌 专性好氧菌 strictaerobe 必须在有分子氧的条件下才能生长 有完整的呼吸链 以分子氧作为最终氢受体 细胞含有超氧物歧化酶 SOD 和过氧化氢酶 绝大多数真菌 多数细菌和放线菌 在有氧或无氧条件下均能生长 但有氧情况下生长得更好 在有氧时靠呼吸产能 无氧时接发酵或无氧呼吸产能 细胞含有SOD和过氧化氢酶 许多酵母菌和不少细菌 微好氧菌 microaerophilicbacteria 只能较低的氧分压下才能正常生长 通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能 霍乱弧菌 发酵单胞菌属 弯曲菌属等 兼性好氧菌 facultativeaerobe 耐氧菌 aerotolerantanaerobe 可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌 生活不需要氧 分子氧也对它无毒害 不具有呼吸链 依靠专性发酵获得能量 细胞内存在SOD和过氧化物酶 但缺乏过氧化氢酶 厌氧菌 anaerobe 分子氧对它有毒害 短期接触空气 也会抑制其生长甚至致死 在空气或含有10 CO2的空气中 在固体培养基表面上不能生长 只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长 生命活动所需能量通过发酵 无氧呼吸 循环光合磷酸化或甲烷发酵提供 细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶 大多数还缺乏过氧化氢酶 各类菌所含对氧解毒酶 专性好氧菌SOD 过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD 过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD 过氧化物酶 在培养不同类型的微生物时 要采用相应的措施保证不同微生物的生长 培养好氧微生物 需振荡或通气 保证充足的氧气 培养专性厌氧微生物 需排除环境中的氧气 同时在培养基中添加还原剂 降低培养基中的氧化还原电位势 培养兼性厌氧或耐氧微生物 可深层静止培养 影响膜表面电荷的性质及膜的通透性 进而影响对物质的吸收能力 改变酶活 酶促反应的速率及代谢途径 如 酵母菌在pH4 5 5产乙醇 在pH6 5以上产甘油 酸 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度 从而影响营养物质吸收 或有毒物质的毒性 三 pH值对微生物生长影响 一 环境pH值对微生物生长的影响 微生物的生长pH值范围极广 从pH10都有微生物能生长 但是绝大多数种类都生活在pH5 0 9 0之间 微生物生长的pH值三基点 各种微生物都有其生长的最低 最适和最高pH值 低于最低 或超过最高生长pH值时 微生物生长受抑制或导致死亡 二 不同微生物对pH要求不同 不同的微生物最适生长的pH值不同 根据微生物生长的最适pH值 将微生物分为 嗜碱微生物 硝化细菌 尿素分解菌 多数放线菌耐碱微生物 许多链霉菌中性微生物 绝大多数细菌 一部分真菌嗜酸微生物 硫杆菌属耐酸微生物 乳酸杆菌 醋酸杆菌 微生物名称pH值最低最适最高Thiobacillusthiooxidans氧化硫硫杆菌0 52 0 3 56 0Lactobacillusacidophilus嗜酸乳杆菌4 0 4 65 8 6 66 8Rhizobiumjaponicum大豆根瘤菌4 26 8 7 011 0Azotobacterchroococcum圆褐固氮4 57 4 7 69 0Nitrosomonassp 硝化单胞菌7 07 8 8 69 4Acetobacteraceti醋化醋杆菌4 0 4 55 4 6 37 0 8 0Staphylococcusaureus金黄葡球菌4 27 0 7 59 3Chlorobiumlimicola泥生绿菌6 06 87 0Thurmusaquaticus水生栖热菌6 07 5 7 89 5Aspergillusniger黑曲霉1 55 0 6 09 0一般放线菌5 07 0 8 010 0一般酵母菌3 05 0 6 08 0 不同微生物的生长pH值范围 一些常见微生物生长的pH值范围 同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中 对环境pH值要求不同 例如 丙酮丁醇梭菌在pH值 5 5 7 0时 以菌体生长为主在pH值 4 3 5 3时 进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同 可能积累不同的代谢产物 例如 黑曲霉pH值 2 3时 产物以柠檬酸为主 只产少量草酸 pH值在7左右时 产物以草酸为主 只产少量柠檬酸 几种抗生素产生菌的生长与发酵的最适pH微生物生长最适pH合成抗生素最适pH灰色链霉菌6 3 6 96 7 7 3红霉素链霉菌6 6 7 06 8 7 3产黄青霉6 5 7 26 2 6 8金霉素链霉菌6 1 6 65 9 6 3龟裂链霉菌6 0 6 65 8 6 1灰黄青霉6 4 7 06 2 6 5 三 微生物细胞内的pH值 虽然微生物生活的环境pH值范围较宽 但是其细胞内的pH值却相当稳定 一般都接近中性 这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值 微生物胞内酶的最适pH值一般为中性 胞外酶的最适pH值接近环境pH值 四 微生物的生命活动对环境pH值的影响 微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变 原因 由于有机物分解 分解糖类 脂肪等 产生酸性物质 使培养液pH值下降 分解蛋白质 尿素等 产生碱性物质 使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收 铵盐吸收 NH4 2SO4H2SO4 pH 硝酸盐吸收 NaNO3NaOH pH 培养过程中调节pH值的措施过酸时 加入碱或适量氮源 提高通气量 过碱时 加入酸或适量碳源 降低通气量 NH4 被吸收 NO3 被吸收 配制培养基时调整pH值的措施 第四节微生物培养法 一 良好的微生物培养装置的基本条件二 实验室培养法三 生产实践中培养微生物的装置 1 按微生物的生长规律进行科学的设计 提供丰富 均匀的营养物质 2 保证微生物获得适宜的温度和良好的O2条件 3 为微生物提供适宜的理化条件 4 严防杂菌的污染 一 良好的微生物培养装置的基本条件 二 实验室培养法 固体培养法 好氧菌的固体培养 试管 平皿 三角瓶 厌氧菌的固体培养 高层琼脂柱 厌氧培养皿 Hungaterool tubetechnique 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术 液体培养法 好氧菌的液体培养 厌氧菌的液体培养 试管液体培养 三角瓶浅层液体培养 台式发酵罐 摇瓶培养 Brewer皿 高层琼脂柱 亨盖特技术 培养厌氧菌的试管及平皿 AnaerobicGloveBox 厌氧罐anaerobicjar Differentculturemethods LiquidCulture Batchculture Batch Continuousculture 10ml 20ml 1L 1L 1000L Fermentor 三 生产实践中培养微生物的装置 固态培养法 好氧菌 曲法培养 厌氧菌的堆积培养 深层液体通气培养 发酵罐 Fermenter 液体培养法 浅盘培养 挂曲 小曲 红曲 发酵罐 fermenter 第五节有害微生物的控制 一 几个基本概念二 物理灭菌温度的代表 高温三 常用的化学控菌方法 一 几个基本概念 灭菌 sterilization 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施 称为灭菌 灭菌还可分杀菌 菌体虽死 形体尚存 溶菌 菌体被杀死后 细胞自溶 裂解消失 消毒 disinfection 采用较温和的理化因素 仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌 而对被处理物体基本无害的措施 称为消毒 防腐 antisepsis 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖 从而达到防止物品发生霉腐的措施 称为防腐 化疗 chemotheraphy 即化学治疗 利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖 以达到治疗该传染病的一种措施 低温 利用4 以下的各种低温以保藏食物 药品 菌种等 缺氧 在密闭容器中加入除氧剂 如铁粉 真空保藏也是比较常用的方法 干燥 采用晒干或红外线干燥保藏粮食 食品等 或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用 高渗 通过盐渍或糖渍达到高渗 高酸度 如泡菜 酸菜等 高醇度 用酒保存食品 防腐剂 苯甲酸 山梨酸 脱氢醋酸等 防腐的措施 1 高温的致死作用 高温引起蛋白质 核酸 脂类等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等 从而变性失活而导致微生物死亡 二 物理灭菌温度的代表 高温 一 高温灭菌的种类 高温灭菌 消毒 法是最常用的物理方法 干燥热空气灭菌法 hot airoven 将物品放入烘箱内 然后升温至150 170 维持1 2小时 适用于玻璃 陶瓷和金属物品的灭菌 不适合液体样品 及棉花 纸张 纤维和橡胶类物质的灭菌 1 干热灭菌法 dryheatsterilization 焚烧法 incineration 是将被灭菌物品在火焰中燃烧 使所有的生物质碳化 简单 彻底 但对被灭菌物品的破坏极大 适用于无经济价值的物品灭菌 及不怕烧的实验器具 如接种环 镊子 试管或三角瓶口的灭菌等 特点 由于空气传热穿透力差 菌体在脱水状态下不易杀死 所以温度高 时间长 干热可使细胞膜破坏 蛋白质变性 原生质干燥 并可使各种细胞成分发生氧化变质 同温同压和相同作用时间下湿热比干热灭菌更好 1 湿热蒸汽不但透射力强 更易于传递热量 2 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构 从而加速蛋白质的变性 湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件 多数细菌和真菌的营养细胞 在60 左右处理5 10分钟 酵母菌和真菌的孢子 用80 以上温度处理 细菌的芽孢 121 处理15分钟以上 2 湿热灭菌法 moistheatsterilization 1 常压法 1 煮沸消毒法将水加热至100 煮沸15min 30min 可杀死所有营养细胞和部分芽孢 达到消毒物品的目的 一种低温湿热消毒法 用较低的温度来杀灭物料中的无芽孢病原菌 又不影响其原有风味 适于牛奶 啤酒 果酒 酱油等 该法一般是将待消毒的液体食品置于62 处理30min 然后迅速冷却 即可达到消毒目的 低温维持法 Lowtemperatureholdingmethod LTH 63 30min处理牛奶 高温瞬时法 Hightemperatureshorttime HTST 72 15s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法 Ultrapasteurization 让液体食品停留在140 左右3 4s 急剧冷却至75 经匀质化后冷却至20 2 巴斯德消毒法 Pasteurization 其蒸煮过程可杀死微生物的营养体 但不能杀死芽胞 室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体 再经蒸煮过程可杀死新的营养体 循环三次以上可保证彻底灭菌的目的 适用于不耐高温的物品灭菌 如不适于高压灭菌的特殊培养基 药品的灭菌 缺点是麻烦 费时 3 间歇灭菌法 分段灭菌法 丁达尔灭菌法 过程如下 80 100 下蒸煮15 60min 杀灭其中所有的微生物营养体 室温或37 保温过夜 诱使其中残存的芽孢萌发 第二天再以同法蒸煮和保温过夜 如此连续重复3天 即可在较低的温度下达到彻底灭菌的效果 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升 以达到100 以上高温灭菌的方法 利用高温 非压力 进行湿热灭菌的方法 方法 121 1kg cm2或15磅 英寸2 维持15 20min 112 0 5kg cm2或8磅 英寸2 20 30min 115 0 75kg cm2或11磅 英寸2 20 30min 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如 生理盐水 营养琼脂等培养基用121 含葡萄糖 乳糖 氨基酸等培养基用112 适用 耐高温物品 玻璃仪器 含水或不含水的物品 2 加压法 1 高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌锅 注意事项 排净冷空气 灭菌终了 缓慢降压 灭菌结束 趁热取出物品 2 连续加压蒸汽灭菌法 连消法 3 利用温度进行杀菌的定量指标 热死时间 在某一温度下 杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间 如 E coli在60 下为10min 热死温度 热死点 在一定时间内 一般为10min 杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最低温度 多数细菌 酵母菌 霉菌的营养细胞和病毒 在50 65 10min即可致死 梅毒密螺旋体43 10min即可致死 二 影响加压蒸气灭菌效果的因素 1 灭菌物体的含菌量2 灭菌锅内排除空气的程度3 灭菌对象的pH值pH 6 0时 微生物易死亡 pH6 0 8 0时 不易死亡 4 灭菌对象的体积5 加热与散热速度 三 高温对培养基的影响及其防止措施 高温对培养基的不利影响 形成不溶性沉淀 营养成分被破坏 PO4 3存在 葡萄糖生成酮糖 微生物不能利用 色泽加深 褐变如产生氨基糖等 梅拉特反应 改变培养基的pH值 通常下降0 2 形成有害物质 抑制微生物生长 消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂 用于杀菌或抑菌的化学因素很多 用途广泛 性质各异 三 化学杀菌剂 消毒剂和治疗剂 关于表面消毒剂 化学杀菌剂或化学治疗剂的药效和毒性的3个指标 最低抑制浓度 评定某化学药物药效强弱的指标 指在一定的条件下 某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度 半致死量 评定某药物毒性强弱的指标 指在一定条件下 某化学药剂能杀死50 实验动物时的剂量 最低致死量 评定某药物毒性强弱的另一指标 指在一定条件下 某化学药剂能引起实验动物群体100 死亡率的最低剂量 消毒剂 对一切活细胞都有毒性 不能用作活细胞内或机体内治疗用的化学药剂 主要用于抑制或杀灭物体表面 器械 排泄物和环境中的微生物 如皮肤 粘膜 伤口等处防止感染 一 表面消毒剂 1 消毒防腐剂的作用机理 使微生物蛋白质凝固变性 发生沉淀 如酒精等 破坏菌体的酶系统 影响菌体代谢 如过氧化氢等 降低微生物表面张力 增加细胞膜的通透性 使细胞发生破裂或溶解 如来苏儿等酚类物质 2 消毒剂杀菌的规律 低浓度时 会对微生物的生命活动起刺激作用 随浓度的增加 相继出现抑菌和杀菌作用 因而形成一个连续的作用谱 3 表面消毒剂的相对杀菌强度 石炭酸系数 P C 在一定时间内 被试药剂杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸最高稀释度之比 时间 10min 供试菌 Salmonellatyphi 伤寒沙门氏菌 如 P C 300 100 3 常用的消毒防腐剂及其应用 常用的消毒防腐剂及其应用 常用的消毒防腐剂及其应用 能够特异性地作用于某些微生物并具有选择毒性的化学药剂 它们与非特异的化学药剂相比对人体几乎没有什么毒性或