四环素类药物残留.ppt

高效液相色谱法测定鲜 冻禽产品中四环素类农药残留量 08商检3班第十组 常用于临床的四环素类抗生素有 金霉素 土霉素 四环素 强力霉素等 来源土霉素由龟裂链丝菌 四环素由黑白链丝菌 金霉素由金色链丝菌的培养液提取而得 四环素还可用金霉素除去氯元素而获得 性状四环素类药物的抗菌作用 在碱性水溶液中下降 而在酸性水溶液中则稳定 四环素类药物分为金黄色或黄色晶粉 无臭 味苦 易溶于水 遇光则色渐变暗 故须密封 遮光 在干燥处保存 其水溶液的稳定性以四环素为佳 但一般均须以新鲜配制为宜 如不能立即用完 应放于低温 4 以下 处保存 作用与用途四环素 土霉素 金霉素及多四环素为四环素类兽医专用药 该类药物为广谱抗生素 具有良好的抑菌效果 因其价格便宜 目前仍广泛应用于畜禽 水生生物等产业领域 但由于不合理使用以及不遵守休药期 WDT 等 造成该类药物及其降解产物残留于动物组织及畜产品中 必然会危及人类的健康 因此 为了控制四环素类药物在动物性食品中的残留 欧盟 美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物的最大残留限量为0 1mg L 四环素类药物 目前四环素类抗生素的含量测定方法有微生物法 高效毛细管区带电泳法 薄层色谱法及高效液相色谱法 HPLC MS MS等 本实验选择独特的样品处理方法 建立了一种快速 准确 分离度好的高效液相色谱法 实验原理 色谱条件美高效液相色谱仪色谱柱 HypersilODS C18 柱 150 6 2mm 5 m 流动相 A泵乙腈 水 0 01mol L B泵0 01mol L磷酸二氢钠溶液 用30 硝酸溶液调节至pH 2 5 35 65 A B使用前用超声波脱气10min 流速 1 0ml min 柱温 室温 灵敏度 0 002AUFS 检测波长 355nm 进样量 10 L ODS C18 样品经提取 微孔过滤膜过滤后直接进样 用反向色谱分离 紫外检测器检测 与标准比较定量 出峰顺序为土霉素 四环素 金霉素 色谱柱的选择用于分离四环素类化合物的色谱柱种类较多 包括C18柱 C8柱 ODS柱 苯基柱等 考虑到四环素类物质在水中溶解度很小 且分子量很小 正相键合相和反相键合相均可使用 但由于其分子中含酚羟基和烯酸型羟基 具有一定极性 若选用正相键合相色谱柱 可能会由于正相键合相的极性很大 二者的作用力很强 造成洗脱困难 保留时间过长的情况 所以 选择反相键合相更为适宜 加之 四环素类药物分子中含酚羟基和烯酸型羟基显弱酸性 同时含有二甲胺基显碱性 为两性化合物 在一定pH值下可以解离 在反相键合相的条件下 调节pH值至合适范围 可获得适宜保留值 达到满意分离 本实验中选择了反相键合相色谱柱 并对C8和C18键合相的分离能力进行了对比分析 结果表明C18色谱柱分离效果较好 这可能是由于C18色谱柱填料粒径小 表面积大 柱效高 从而增强了溶质分子的分离度 加之其有较高的C含量和更好的疏水性 对于各种类型的样品分子具有更强的适应能力 所以在测定和分析禽产品中四环素类药物多残留时可以优先考虑使用C18作为实验用柱 试剂与配制 土霉素 0TC 四环素 TC 金霉素 CTC 标准储备液 准确称取0TC TC CTC固体标准品各0 0100g 0TC TC用0 1mol L盐酸溶解定容至10 00mL CTC溶于蒸馏水定容至10 00mL 此三种标准储备液含量为1mg mL 4 下可保存一周 混合标准溶液 取0TC TC标准储备液各1 00mL CTC标准储备液2 00mL 用蒸馏水定容至1Oml 此混合标准液中OTC TC含量分别为100 g ml ppm CTC含量为200 g ml ppm 当天配制当天使用 5 高氯酸溶液0 01mol L磷酸二氢钠溶液 称取1 56g磷酸二氢钠溶于100mL水中 用30 硝酸调节PH至2 5 经微孔滤膜过滤 超声备用 乙腈分析纯 样品预处理将动物组织解冻 匀质 准确称取5 00g 0 01g 置于50ml追星瓶中 加入5 的高氯酸溶液25ml 于超声波振荡器上振摇10min 以2000r min高速离心3min 取上清液 经0 45 m滤膜过滤 取10 L进样 从工作曲线上查得含量 工作曲线分别称取7份切碎的肉样 每份5 00g 精确到 0 01g 分别加入混合标准溶液0 25 L 50 L 100 L 150 L 200 L 250 L 含土霉素 四环素各0 2 5 g 5 0 g 10 0 g 15 0 g 20 0 g 25 0 g 按试样测定方法操作 以峰高为纵坐标 抗生素含量为横坐标 绘制标准曲线 结果计算x 式中 x为样品中抗生素含量 mg kg A为样品溶液测得的抗生素质量 mg m为样品质量 g 操作步骤 这是在GB T20764 2006中截取的标准物质色谱图 用的是液相色谱 紫外检测法 与书本所述方法有所区别 在这列出作为参考 出峰顺序依次为土霉素 四环素 金霉素 参照GB T60764 2006 GB T21317 2007中测定四环素类兽药残留的相关方法 为使方法更为准确可靠 在原实验的基础上 可以再做回收率及精密度试验回收率及精密度试验 分别向5mL空白样品中添加混合标准溶液制成0 05 0 1 0 2 g ml3种浓度的标准回收溶液 按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验 每个添加做5个平行 我说我见解 注意事项 1 由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合 因此需要用强酸或酸性脱蛋白剂从生物制品中提取 2 四环素在酸性水溶液中紫外270nm处有最大吸收 3 不同ph值流动相条