抗氧化活性.doc

1. 徐春兰,钦传光,尚晓娅,牛卫宁. Enterobacter CloacaeZ0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化活性.化学研究，2010，21（2:）64-68.CHEMICALRESEARCH 多糖是自然界中与人类生活紧密相关的一类天然生物高分子,具有免疫调节、抗氧化等多种生物学功能.国内外近年来对于多糖的抗氧化作用进行了广泛的研究1,2,并有人据此解释了多糖抗衰老功效的药理机理.1.3E.cloacaeZ0206富硒多糖的制备取出冷藏的E.cloacaeZ0206菌种,室温放置1 h后,在PDA培养基上2次活化后,接种到基础发酵培养基中进行试管发酵培养,30往复振荡培养,培养时间10 h,得到摇瓶发酵种子液. 2 000 mL摇瓶内加入500 mL基础发酵培养基,121蒸汽灭菌20 min,接种种子液,于摇床中30、220 r/min往复振荡培养,在培养的第6 h加入一定浓度的已过滤除菌的Na2SeO3溶液(使其终浓度为25 mg/L),发酵时间48 h,得到含有E.cloacaeZ0206富硒多糖的发酵液.发酵液于50浓缩为原体积的1/10, 90水浴1 h,5 000 r/min离心20 min,收集上清液,加入35倍体积预冷的95%乙醇,4静置24 h后, 5 000 r/min离心20 min,沉淀真空干燥,即得到粗多糖粉末.将其溶于适量蒸馏水,Sevag法除蛋白,反复进行多次至无蛋白层,然后用自来水和蒸馏水各透析24 h,透析液中加无水乙醇,置4冰箱中醇沉过夜,再离心分离,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次,真空干燥,即得到E.cloacaeZ0206富硒多糖.E.cloacaeZ0206富硒多糖中多糖的测定采用苯酚-硫酸法,蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法,硒含量的测定采用紫外分光光度法.1.4清除DPPH自由基试验准确地将E.cloacaeZ0206富硒多糖配成5.0 g/L,用超纯水将该溶液稀释成6种浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.以维生素C(Vc)为对照品.称取20 mg的DPPH用无水乙醇溶解定容至500 mL.试验分为样品组和空白对照组:取2 mL 40 mg/L的DPPH溶液加入10 mL具塞的试管中,再加入2 mL样品溶液,空白对照组以超纯水代替样品溶液,充分混匀,室温下避光反应30 min后,在517 nm处测定吸光度.E.cloacaeZ0206富硒多糖清除DPPH自由基的能力由下式计算:DPPH自由基清除率=(A0-A1)/A0100%,式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.1.5清除羟自由基试验由Fenton法产生OH.将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5 g/L的多糖溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.各取2 mL上述浓度的多糖溶液,依次加入6mmol/L的FeSO4溶液2 mL,混匀,6 mmol/L的H2O2溶液2 mL,混匀,静置30 min后于510 nm处测其吸光度值.空白对照组以双蒸水代替多糖溶液,以维生素C(Vc)做对照,临用前以双蒸水配制.羟自由基的清除率以下式计算:羟自由基清除率=(A0-A1)/A0100%,式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.1.6清除超氧阴离子自由基试验采用邻苯三酚自氧化法产生O-2进行试验.将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5g/L的多糖溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L.取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)4.5 mL,置于25水浴中预热25 min,分别加入1 mL不同浓度的多糖溶液和0.4 mL25 mmol/L邻苯三酚溶液,空白对照组以双蒸水代替多糖溶液,混匀后在25水浴中反应5 min,加入1mL 8 mol/L的HCl终止反应,于299 nm处测吸光度.超氧阴离子的清除率以下式计算:超氧阴离子的清除率=(A0-A1)/A0100%,式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为试样的平均吸光度值.1.7还原能力的测定将E.cloacaeZ0206富硒多糖用双蒸水配制成质量浓度为5 g/L的多糖溶液,并稀释成6个不同浓度:0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5 g/L,各取1 mL上述浓度的多糖溶液,加入pH 6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL、1%铁氰化钾2.5 mL,混合均匀后于50水浴中保温20 min,再加入10%的三氯乙酸2.5 mL,混匀,以3 000 r/min离心10 min,移取上清液2.5 mL于试管中,加蒸馏水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL,常温反应5 min后于700 nm处测定吸光度值,OD700 nm值越大说明测试样的还原能力越强,实验中选用Vc做对照.2. 谢辉,李莉,吴鸣谦,陈双林*1株杜仲内生真菌的抗氧化活性分析和菌种鉴定. 安徽农业科学,Journal ofAnhui Agri.Sci.2009,37(1):230-232Harper等的研究表明,植物内生真菌具有抗氧化活性或可产生天然的抗氧化活性产物3-4。而在杜仲内生真菌抗氧化活性的研究上,霍娟等应用TBA反应法对从杜仲叶片中分离到的内生真菌刺孢壳(Chaetomellasp.)培养液提取物进行了抗氧化活性的测定,发现该菌能够产生抗氧化活性成分,TLC和HPLC的分析表明活性成分为黄酮类化合物5. 利用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定菌株发酵液粗提物的总抗氧化活性,进行菌种筛选。菌株No.173表现出最高的总抗氧化活性,达到20.70 U/ml,故选定其作为供试菌种.1.2.1杜仲内生真菌菌株No.173发酵液提取物的制备。采用马铃薯葡萄糖液体培养基为发酵培养基,250ml三角瓶装液量为100ml。挑取No.173少许菌丝接种于液体培养基中,(261)、100r/min培养7 d后过滤除去菌丝,滤液于(601)减压浓缩至黏稠状,加入适量无水乙醇(终浓度为85%),10 000r/min离心10 min,弃沉淀,上清液蒸去乙醇,上NKA-9大孔吸附树脂,80%乙醇洗脱,合并洗脱液,减压浓缩至黏稠状冷冻干燥,得到黄褐色粉末状活性物质。1.2.2杜仲内生真菌菌株No.173发酵液提取物抗氧化能力测定8。精确称取相当于猪油质量的0.01%、0.02%、0.04%、0.06%的No.173菌株的发酵液提取物,分别放入锥形瓶中,加入少量超纯水溶解,同时以相应体积的超纯水代替样品作空白对照,以0.04%的Vc和0.04%的VE代替样品作阳性对照,再加入50.0 g猪油,搅拌均匀。将所有试样置于(601)烘箱中强化保存,每24 h搅拌1次,并测定其过氧化值(POV)。每组处理均设3个平行。过氧化值的测定按GB5009.37-2003滴定法进行9。3HARPERJK,ARIFAM,FORDEJ,etal.Pestacin:A1,3-dihydro isobenzofu-ranfromPestalotiopsismicrospora possessingantioxidant and antimycotic activi-tiesJ.Tetrahedron,2003,59(14):2471-2476.4 LIUXL,DONGMS,CHENXH,etal.Antioxidant activity and phenolicsofanEndophytic Xylari asp.fromGinkgo bilobaJ.Food Chemistry,2007,105:548-554.5霍娟,陈双林.杜仲内生真菌抗氧化活性J.南昌大学学报:理科版,2004,28(3):270-275.6沈书庆,殷红,刘芸,等.产杜仲黄酮内生真菌的初步研究J.菌物研究,2008,6(1):46-48.3. 姜俊杰，邢莹莹，陆园园，奚 涛.北极放线菌 T-2-3 胞外多糖体外抗氧化作用研究. 药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2012，19( 4) : 313 316生物体内源和外源性自由基均会导致生物体氧化损伤，从而诱发各种疾病( 癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、高血压等) 及促进衰老。为保护生物体，避免氧化损伤，寻找外源性的自由基清除剂和抗氧化剂成为人们不懈的努力方向1。目前，多糖中研究得较为热门的是植物多糖、海藻多糖和真菌多糖，而从细菌中、动物活体中提取多糖研究较少2. 1. 1 材料1. 1. 1 北极放线菌 T-2-3 胞外多糖 ( Arctic Streptomyces sp. extracellular polysaccharide，ASEP) 为中国药科大学生物技术中心自制。T-2-3 是利用平板稀释法从北极黄河站附近海域潮间带的 9 个不同采样点的海泥样本中分离得到，原始菌株保藏于中国药科大学生物技术中心。经黄豆发酵液摇瓶发酵 7d 后，过滤收集发酵液，按醇沉法提取并经Sevage 法除蛋白，制备得到水溶性北极放线菌胞外多糖ASEP，经硫酸-苯酚法检测 ASEP 总糖含量 61. 7% 。ASEP经 DEAE-52 离子交换层析柱分离得到 ASEP-3，硫酸-苯酚法测定总糖含量为 99. 1%。1. 1. 2 总还原能力测定试剂盒、超氧阴离子自由基( O2) 、羟基自由基(OH) 、H2O2和丙二醛( MDA) 测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所; VE( 1028 I. U/g) 、牛血清白蛋白: 购自 Sigma 公司。1. 1. 3 ICR 小白鼠，清洁级，雄性，体重 20 2 g，购自江苏省京青龙山养殖场。1. 1. 4 主要仪器 玻璃组织匀浆器; UV-721 紫外可见分光光度计; 低温高速离心机; 恒温水浴锅。1. 2 方法1. 2. 1 总还原能力( T-AOC) 的测定 HTSS 参照总还原能力( T-AOC) 测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0，1. 2，1. 4，1. 6 和1. 8 mg / mL，每个样品在 520处以蒸馏水为空白测定其吸光值，平行测定 3 次，取其平均值。1. 2. 3 清除超氧阴离子自由基能力测定 参照抗超氧阴离子自由基测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 50，100，150，200 和 250g/mL，每个样品在 546处以蒸馏水为空白测定其吸光值，平行测定 3 次，取其平均值。按下述公式计算超氧阴离子( O2) 清除率:O2清除率( %) = ( 1 A样品/ A对照) 100其中，A样品为加不同浓度的多糖实验组吸光度值，A对照为以等体积蒸馏水代替多糖溶液的对照组吸光度值。1. 2. 4 清除羟自由基能力测定 参照羟自由基测试盒的方法，ASEP 或 ASEP-3 在反应体系中的终浓度分别为 50，100，150，200 和 250 g / mL，每个样品在 542处以蒸馏水为空白测定其吸光度，平行测定 3 次，取其平均值。按下述公式计算羟自由基(OH) 的清除率:OH 清除率( %) = ( 1 A样品/ A对照) 100其中，A样品为加不同浓度的多糖实验组吸光度值，A对照为以等体积蒸馏水代替多糖溶液的对照组吸光度值。1. 2. 5 清除 H2O2能力测定 参照 H2O2测试盒的方法4. 霍娟,双林.杜仲内生真菌抗氧化活性. 南昌大学学报(理科版),2004,28( 3):270-273杜仲Eucommia ulmoidesOlive.是单科单属单种的珍稀木本药用植物,现代医学根据药理实验和临床应用认为杜仲具抗衰老、抗氧化、降压、消炎、抗癌等多种功效;同时还证实,杜仲叶与其传统药用部分皮的化学成分基本一致,具有同等功效,可以替代1。本实验尝试从杜仲叶片中寻找能够产生与其活性成分类似产物的内生真菌,为通过真菌发酵开发相应的活性产物奠定基础.122培养液提取物的制备菌种活化后点接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面上,26培养至产孢。倒入无菌水,震荡制成孢子悬液,取1 mL(浓度为107个/mL)孢子悬液接入丝状真菌基本培养液中,26、150 r/min培养,6 d后过滤除菌丝,滤液减压蒸发浓缩至粘筒,加入足量无水乙醇震荡,提取,5 000 r/min离心15 min,弃沉淀,留上清,再浓缩至粘稠后至于干燥器中,得提取物粗品。123培养液提取物的抗氧化活性测定采用TBA反应法3-4,稍加以改进。配制2.5%的亚油酸乙醇溶液作为底物溶液,在各瓶底物溶液中分别加入0.02%(w/w)的芦丁、维生素E、抗坏血酸和该菌株培养液提取物,混匀后置于37存放。每隔24 h取1 mL待测样品,加入1 mL 25%的三氯乙酸,混匀、放置5 min,然后加入1 mL0.67%的TBA,于沸水浴中加热20 min。取出,冷却,再加入4 mL正丁醇,剧烈震荡,于4 000 r/min下离心10 min,取上层正丁醇液,于532 nm波长下比色。以蒸馏水代替抗氧化剂的空白样品作为对照,在不同的存放时间下测得各OD532值。OD532值越小表明抗氧化剂的抗氧化性能越高。杜连德.工业微生物学实验技术M.天津:天津科学技术出版社,1992.278.3陈代杰.微生物药物学M.上海:华东理工大学出版社,1999.342-353.5. 刘方陈亮赵力2王东李巍李乐牛淑。放线菌类培养滤液体外自由基清除和抗氧化活性的研究 目前，大量的文献报道，来自植物中的多酚类、黄酮类等具有明显的自由基清除活性和抗氧化作用.但是植物资源有限，人工栽培成本高，且这些化合物有一定的副作用，因此广泛使用受到一定的限制.我国有丰富的放线菌资源，并且放线菌发酵培养价格低廉.因此，从放线菌类中筛选含有自由基清除活性和抗氧化作用成分的菌种，既具有理论意义，又有应用价值.有关这方面的研究目前国内外均未见报道.构祀子是我国传统名贵中药材，具有滋补肝肾，益精明目之功效;现代临床上广泛用于降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤、抗衰老等。王心广，曹有龙。枸杞抗氧化功能研究进展。宁夏农林科技，2011，52（11）：48- 52枸杞（Lycium chinense）是一种重要的药用植物，其果实又称枸杞子。枸杞子味甘、性平，归肝、肾经，具滋补肝肾、益精明目、延缓衰老等功效1。在我国西北、华北各地所产枸杞中，以宁夏枸杞品质最佳2。枸杞中的药用成分多样，主要有多糖（包括蛋白聚糖）、糖脂、类黄酮、类胡萝卜素、生物碱、微量元素、多种维生素等3。现代研究已经证实了枸杞的这些传统功效，同时也发现它有降低血糖含量、抗脂肪肝、防止动脉硬化、抗癌、增强机体免疫力、防止老年痴呆症等作用3- 4。与这些传统和现代功能有密切关系的，或者说贯穿这些多种功能的，是枸杞的抗氧化功能，因为由活性氧导致的氧化胁迫和氧化损伤是造成人体多种器官疾病和机体衰老的一个重要原因5- 6。综合表 1 的情况来看，枸杞中多种化学成分都有抗氧化的效果。其中枸杞多糖（包括糖偶联物和多聚糖）是研究的最多、最充分的一种，并且它在全身多个器官中都具有抗氧化的活性。有的研究甚至对某些特定多糖的抗氧化活性也进行了探索，比如枸杞多糖- 420。多糖作为一种对抗氧化胁迫的有效成分，在其他物种中也有过报道21- 22。不过在植物多糖抗氧化方面，枸杞多糖应该是研究的比较多的一种。总黄酮是枸杞中另一类主要的抗氧化活性成分，它可以有效地清除超氧离子和氢氧自由基，降低脂类分子过氧化23- 24。另外，枸杞中所含的玉米黄素（Zeathanthin）和黄体素（Lutein）也具有很好的抗氧化活性27- 28。其它研究过的枸杞抗氧化成分还包括黑果枸杞色素29、AA- 2G（2- O- - D- glucopyranosyl- L- ascorbic acid，一种维生素 C类似物）30枸杞多糖的抗氧化能力可与维生素C 相比，并且二者结合可进一步增强抗氧化活性。2.3 枸杞的抗氧化特性枸杞的抗氧化功能可以归纳为3 个方面：清除多种活性氧自由基；提高抗氧化蛋白的活性或水平；降低生物分子氧化物的产生。作为一种重要的传统中药，枸杞的功效已经得到医药实践的证实。在过去十几年里，生命科学也开始了利用现代分析测试技术对枸杞药效功能进行探索。这些探索不仅佐证了枸杞的传统功效，而且揭示了枸杞的有效生化成分和保健机理。现代生命科学确立了枸杞对人体全身多器官系统的保护和功能改善，其中贯穿它的整体多部位保健的一个普遍机理是它的抗氧化功能。枸杞中的多种生化成分，包括多糖、类黄酮、类胡萝卜素（像玉米黄素和黄体素），都有良好的抗氧化功能。它们可以在身体的多个部位、不同的细胞类型中有效提高抗氧化蛋白的活性（或蛋白量），清除活性氧自由基，降低脂类、蛋白质和 DNA过氧化物的产生，进而保护细胞器、细胞内的氧化还原环境和机体功能。摘要:构祀和地骨皮为植物构祀的不同药用部位。构祀为茄科植物构祀成熟果实，它在祖国的传统医学中具有重要的地位，有”红宝”之称，其药用价值备受历代医家的推崇，是现代养生之佳品。本草纲目记载:“构祀，补肾生精，养肝，明日，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明日安神，令人长寿”。地骨皮为茄科植物构祀的干燥根皮。传统本草认为其性寒，有凉血除蒸、清肺降火之功效，主要用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，肺热咳嗽，咯血，蛆血及内热消渴等方面。现代药理研究表明两者均有降血糖，降血脂，调节机体免疫，降血压，刺激成骨样细胞增殖，抑制骨松质，降低骨密度，保护肝肾细胞等作用。构祀多糖是构祀的主要有活性分，研究比较深入的是其较强的抗氧化，抗衰老作用，除此之外，构祀还具有抗疲劳，抗肿瘤，抗辐射，神经保护作用及生殖系统保护，用于治疗青光眼等。而地骨皮解热镇痛抗菌的作用被广泛应用，含有褪黑素，可通过改变生物节律来有效促进生理性睡眠冲动，改善睡眠质量，还具有抗生育的作用枸杞子(Fructus lycii)是茄科植物宁夏枸杞(Lycium barbarumL.)的成熟干燥果实,具有滋补肝肾、益精明目之功效,现代临床上广泛用于调节免疫功能、降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤及抗衰老等1,上述生理药理活性都与其抗氧化活性相关。一般认为枸杞子的抗氧化作用主要与其所含枸杞多糖、类胡萝卜素和甜菜碱等活性成分有关2。然而,随着对植物抗氧化活性的深入研究,人们发现植物的抗氧化活性及其它活性并非其中某一种成分起作用,而是多种成分协同作用的结果。大量的研究1结果表明:枸杞子中具有抗氧化活性的水溶性成分主要有枸杞多糖、水溶性类黄酮、22O22D2葡萄糖基2L2抗坏血酸及维生素C等;具有抗氧化活性的脂溶性成分主要有类胡萝卜素等脂溶性色素、脂溶性类黄酮、维生素E等,80%醇提物含有大量的枸杞黄酮化合物。1.3.3 抗氧化活性物质抗氧化能力的测定1.3.3.1 DPPH 自由基清除率的测定采用Yamaguchi 等13方法,取 0.1 mL 提取液同1.0 mLDPPH 乙醇溶液混匀，于 37 反应 60 min 后在 517 nm处比色。 DPPH 自由基清除率用以下方程式计算:1.3.3.2 FRAP 法测定抗氧化能力采用Benzie 等14方法,取 200 L 提取液同 6.0 mLFRAP 工作液(0.3 mol/L pH 3.6 乙酸钠缓冲液、10 mmol/LTPTZ 和 20 mmol/L 三氯化铁以体积比 1011 混和)混匀，37 反应10 min,于 593 nm 处测定吸光值,吸光值(OD593)的大小与样品的抗氧化能力成正比。抗氧化活性测定试验中均选定100 g/mL V C为阳性对照。7. 史佳琴，周松林，王梅霞，陈双林.槐树内生真菌抗氧化活性的初步研究. .食品科学2007, 28(8):250-253 1.2.2 槐树内生真菌培养液提取物的制备槐树内生真菌菌株活化后，取少量菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，250ml三角瓶，100ml装液，26、150r/min培养7d。滤除菌丝，滤液用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩，加入等量80%乙醇振荡提取，5000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液再浓缩至黏稠后真空干燥得粗提物。1.2.3 槐树内生真菌培养液提取物抗氧化活性的测定取1.2.2所得粗提物以95%乙醇配制成0.15%(W/V)溶液，芦丁和VC亦制成同浓度乙醇溶液，用总抗氧化能力(T-AOC)测试盒和抑制超氧阴离子自由基(O2-)测试盒分别测定各菌株粗提物的总抗氧化活性和对超氧阴离子自由基(O2-)的抑制能力7-8，测试方法参照测试盒说明书。总抗氧化能力计算公式：总抗氧化能力(U/ml)=(A1A0)/0.0130(反应液总体积/取样量)测试前稀释倍数式中，A0为对照管吸光值(OD)；A1为样品管吸光值(OD)。在37时，每毫升样品使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时定义为一个总抗氧化能力单位超氧阴离子自由基(O2-)清除率(%)=(1A1/A0)100式中，A0为对照OD；A1为样品OD。1.2.4 槐树内生真菌培养液提取物抗氧化活性的碘量法测定取初测总抗氧化活性较高的6株内生真菌的培养液粗提物以95%乙醇配制成0.02%(W/V)溶液，芦丁也制成同浓度乙醇溶液，加入60g 猪油中，充分搅拌，混合均匀，另取猪油60g，添加与处理相同量的无水乙醇作空白对照。将所有样品置于60下强化保存，每24h搅拌一次，用碘量法9逐日测定其过氧化值。每处理均重复3 次，过氧化值取其平均值，10d 之后终止。过氧化值的测定：按GB5009.372003测定10。8. 尚 菲，魏希颖，刘 竹，马彩霞.具有抗氧化活性的绞股蓝内生真菌的分离及研究. 药 物 生 物 技 术Pharmaceutical Biotechnology 2011，18( 6) : 519 5211. 3 药品与试剂绞股蓝皂苷标品购于辽宁生物医药研究中心( 121311-200402) ; 二苯基苦基苯肼( DPPH) 购于 Sigma 公司; PCR 相关试剂购于北京经科宏达生物技术有限公司( DOUPSON) ;分析纯试剂均购于天津市天力化学试剂有限公司; 色谱纯试剂均购于天津市科密欧化学试剂有限公司。1. 4 仪器YXQ-50S型立式压力蒸汽灭菌器，SPX-100B-Z 型生化培养箱( 上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ; SW-CJ-1FD 型单人单面净化工作台 ( 苏州净化设备有限公司) ;BE-52AA 型 旋 转 蒸 发 器 ( 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 ) ;CBILON88-型超声细胞粉碎机 ( 上海比朗仪器有限公司) ; 2F-2 型三用紫外仪( 上海市安亭电子仪器厂) ; LXJ-型离心沉淀机( 上海医用分析仪器厂) ; LC-2010 型高效液相色谱仪 ( 日 本 岛 津 公 司) ; S1000 型 PCR 仪 ( BIO-RAD) 。2. 2 内生真菌代谢产物粗提物的制备于 250 mL 的锥形瓶中加入 100 mL PDB 培养液，将内生真菌接种在 PDB 培养液中，摇床( 28 ，180 r/min) 振荡培养 10 15 d，分别收集菌丝体和发酵液，菌丝体 40 烘干，加入乙醇超声破碎，离心取上清得胞内产物的粗提液。发酵液用水饱和的正丁醇萃取 3 次，浓缩蒸干后用乙醇溶解得胞外产物的粗提液。2. 4 抗氧化活性试验2. 4. 1 有机自由基( DPPH) 清除能力的测定7以无水乙醇配制 2 10 4mol / L 的 DPPH 溶液，避光保存。取 2 mLDPPH 溶液，加入 2 mL 待测样品溶液，充分混合，30 min 后在 517 nm 处测定其吸光度。清除率计算用公式 K =1 ( Ai Aj) /Ac100%( 1)式( 1) 中: Ai =2 mLDPPH 溶液 +2 mL 待测溶液Aj = 2 mL 待测溶液 + 2 mL 无水乙醇Ac = 2 mLDPPH 溶液 + 2 mL 无水乙醇2. 4. 2 Fe3 + 还原力的测定8取 2. 5 mL 样品溶液加入0. 2 mol / L 磷酸缓冲液及 1% 铁氰化钾 2. 5 mL，50 水浴20 min 后急速冷却，加入 2. 5 Ml 10% 三氯乙酸溶液混匀，离心，取上清 5 mL 加入 0. 02% 三氯化铁溶液 5 mL，10 min后于 700 nm 处测定吸光度。2. 5 内生真菌代谢产物中活性成分的初步鉴定2. 5. 1 薄层层析 ( TLC) 采用硅胶 GF254 自制板，展开剂: 氯仿-甲醇-水( 13 7 2) 10 以下放置的下层溶液，点样层析，取出晾干后喷 10%的硫酸乙醇，105 加热数分钟至斑点显色清晰，置紫外光灯( 365 nm) 下检视。2. 5. 2 高效液相色谱( HPLC) 色谱条件: Diamomsil C18( 2) 色谱柱，4. 6 mm 250 mm，5m; 柱温 30 ; 进样体积10 L; 检测波长 203 nm; 流速 0. 8 mL / min; 流动相: 乙腈-水梯度。9. 刘建利.宁夏枸杞内生真菌的分离及抗氧化活性的测定.时珍国医国药2011,22(4):857-860 宁夏枸杞Lycium barbarum是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lyci-um)一种多年生落叶灌木植物,是我国传统的名贵中药材,其果实被誉为“红宝”而驰名中外, 2000年版中华人民共和国药典明确指出入药枸杞为宁夏枸杞。随着人口老龄化的加剧及人们对抗氧化衰老产品的日益需求,抗氧化衰老机制的研究已不仅仅是医学和生物学所涉及的问题,而成了全社会所共同关心的热点。现代生物学关于活性氧和体内自由基增多是促进衰老进程的主要原因的研究越来越引人注目,衰老的自由基学说被越来越多的实验证实。因此,寻找能够高效清除自由基的天然抗氧化物的研究也越来越引起人们的重视。Harper等11从Terminaliamorobensis的一株内生真菌中得到两种异构体pestacin和isopes-tacin，二者既表现出抗菌活性,又显示出抗氧化活性,可以清除溶液中的过氧化物和自由基。许多研究结果已经证明枸杞多糖(LBP)是枸杞的主要功效成分,具有良好的抗氧化活性。但对从宁夏枸杞中分离出内生菌及其活性的研究还未见报道。本研究利用组织分离法对宁夏枸杞内生菌进行分离纯化,并进一步对4株宁夏枸杞内生真菌的发酵产物进行抗氧化活性测定,对于探明宁夏枸杞的道地性以及更好地开发利用提供参考,并为开发新的抗氧化活性生物资源提供基础和依据。1材料1. 1宁夏枸杞采自北方民族大学试验田(3年龄)和宁夏创新公司种植基地(5年龄、9年龄)健康植株上。1. 2测定抗氧化性的4株宁夏枸杞内生真菌随机选择4株作为测定抗氧化活性菌株,分别编号1、2、3、和4。1号和4号分离自果实, 2号分离自叶, 3号分离自茎。2. 5宁夏枸杞内生真菌发酵产物的抗氧化活性测定2. 5. 1试样的制备在无菌工作台上,从保存菌种培养皿上将菌株1、2、3、4用接种环挑取1环接种到装有30 ml PDA液体培养基的100 ml三角瓶内, 28, 150 r/min摇瓶活化1 d,再按10%接种量取上述发酵液接入200mlPDA培养基中,同样条件发酵35 d。取100 ml上述发酵液, 5 000 r/min,离心10 min,将上清液转移至烧杯内后放入恒温水浴锅, 60蒸发浓缩至粘稠固体,再转至干燥箱干燥,分别编号试样1、试样2、试样3和试样4。用蒸馏水配制10, 5, 4, 2. 5, 2, 1 mg/ml待测试样和Vc溶液。2. 5. 2清除羟自由基(OH)活性的测定采用Fenton反应1419。其原理是Fe2+催化H2O2产生羟自由基(OH),加入水杨酸捕捉OH并产生有色物质,该物质在510 nm波长处有吸收峰,因此,测吸光度A510值表示样品清除羟自由基(OH)能力大小,A值越高,说明样品清除羟自由基(OH)能力越弱。在10 ml试管中按表2依次加入各种溶液, 37水浴反应5 h后,在510 nm波长处测定吸光度值记为Ai、Aj、A0。关于内生菌的抗氧化活性已有报道,如赵红涛等20在红树林内生真菌的抗氧化作用研究中,利用Fenton反应、邻苯三酚自氧化法测定浓度为100 mg/ml的红树林内生真菌发酵产物对羟自由基(OH),超氧阴离子(O2-)的清除作用。结果表明,测定的18株内生真菌中,具有清除羟自由基的菌株有9株,抑制率最高达到85. 49%;具有清除超氧阴离子自由基的菌株有10株,抑制率最高达到68. 85%;能够同时对羟自由基和超氧阴离子自由基都具有清除能力的有5株。侯奎等21在葛的根、茎、果实以及果实中分离出128株内生真菌,并采用DPPH自由基酶标仪法对其清除自由基活性进行检测。结果表明,分离出的葛内生真菌普遍具有清除自由基活性,且分离部位不同产地不同所具有的活性也不同。同一部位分离出的不同菌株之间活性也不相同,其中菌株在浓度215 mg/ml的清除自由基活性达到92. 3%。而本研究随机挑选的4种菌株都有清除自由基能力,都有抗氧化活性。从本研究结果来看,枸杞内生真菌是一大类具有抗氧化活性的生物资源,其在抗氧化活性物质研究方面值得进一步的深入研究.10. 马虎飞，王思敏，杨章民 .陕北野生枸杞多糖的体外抗氧化活性食品科学. 2011, 32, (3):60-63枸杞(Lycium chinense Miller)为茄科枸杞属(Lycium L i n n . ) 植物，其果实是一种“药食同源”的功能保健性食品，也是一味常用的补肝益肾中药，其色鲜红，味酸甜。现代医学研究证实其含有多糖、亚油酸、粗蛋白、维生素(VA、VC、VB1、VB2) 、甜菜碱、矿物质( 钙、磷、铁、锌、锰) 等营养成分，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBPs)为枸杞中的主要活性成分之一1 。药理研究表明，枸杞多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、降血脂、降血糖、调节免疫等多种保健功能2。LBPs 是枸杞的主要功效成分，具有良好的抗氧化活性3 。国内外类似的研究也发现，合理摄入天然抗氧化剂可预防和延缓癌症、动脉粥样硬化、痴呆和衰老等退行性疾病的发生与发展 4 - 6 。枸杞属几乎在我国各省均有野生分布或栽培，共有7 个种 3 个变种，其中最负盛名的当属宁夏枸杞。 1 材料与方法1.1 材料与试剂实验所用枸杞采集自陕北榆林地区横山县。1,1 - 二苯基 -2 - 苦基肼(1 ,1 -d ip he ny 1- 2- pi cr yl -hydrazyl，DPPH)、考马斯亮蓝 G-250、铁氰化钾K3Fe(CN)6、三氯乙酸(TCA)、抗坏血酸 美国 Sigma 公司；二丁基羟基甲苯(BHT)、氮蓝四唑(NBT)、吩嗪硫酸甲脂(PMS)、还原型辅酶(NADH)、2- 脱氧 -D- 核糖(DR) 德国 Applichem 公司；溴化甲(KBr)、甲醇、三氯化铁(FeCl3)、双氧水以及无水乙醇等均为国产分析纯。1.2 仪器与设备TU1810 紫外 - 可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；SpectrumGX 型红外光谱仪 美国 Perkin-Elmer 公司。1.3 方法1.3.1 枸杞多糖的分离纯化称取 100g 陕北野生枸杞，粉碎后脱脂，将粉末置于圆底烧瓶中加入 95% 乙醇，搅拌、80水浴，冷凝回流 4h ，倒出乙醇，自然干燥。除去脂肪后，加入蒸馏水，于 80水浴 4h，重复 2 次，离心取上清液，将上清液收集到旋转蒸发器，抽真空浓缩，浓缩液加无水乙醇沉淀过夜，重复 3 次。用反复冻融除蛋白 10次以上，随后将滤液装入透析袋内透析 2d，最后在冷冻干燥机上冷冻干燥，得枸杞多糖提取物(LBP)。1.3.2 总糖、糖醛酸及蛋白质含量的测定总糖含量测定采用苯酚 - 硫酸法7 ，糖醛酸分析含量采用硫酸 - 咔唑法8 ，蛋白含量检测采用考马斯亮蓝G-250 染色法9。1.3.3 野生枸杞多糖的红外光谱分析称取 5mg 的LBP，与750mg KBr 充分混匀，压片，红外光谱仪于 4000650cm-1波数范围内扫描。1.3.4 DPPH 自由基清除率的测定参照 Kumaran 等10报道的方法进行：吸取不同质量浓度样品 1mL 于试管中，然后依次加入 3mL 0.004%DPP H 甲醇溶液，充分混匀，避光静置 20 mi n 后，以甲醇作空白对照，517nm 波长测吸光度，以蒸馏水代替样品液作阴性对照，VC 作阳性对照。A1清除率/%=(1 )100A2式中：A1为样品吸光度；A2为蒸馏水吸光度。1.3.5 对超氧阴离子自由基清除率的测定参照张改平等11报道的方法进行：吸取不同质量浓度样品液 1mL 于试管中，依次加入 1mL 0.078mol/LNBT，1mL 0.468mol/L NADH，最后加入 0.4mL 的0.06mol/L PMS 溶液，室温摇匀，后静置 5min，于 560nm波长处测定吸光度，调零组用不同质量浓度样品液1m L，0.4mL 蒸馏水代替 PMS 溶液调零，用蒸馏水作阴性对照，VC 作阳性对照，清除率计算如上所述。1.3.6 对羟自由基清除作用的测定参照Siddhuraju 等12报道的方法进行：取不同质量浓度的样品液1mL，先后加入1.5mL反应液含0.1mmol/LEDTA、0.1mmol/L FeCl3和2.8mmol/L DR 的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，0.35mL H2O2(20mmol/L)，37恒温水浴作用40min 后，终止反应，于532nm 波长处测定吸光度，蒸馏水为阴性对照，VC 为阳性对照，抑制率计算同上所 述 。1.3.7 还原力的测定参照Kumaran 等13报道的方法进行：将 1mL 不同质量浓度的样品液分别与2.5mL磷酸盐缓冲液(pH6.6)及2.5mL 铁氰化钾(1%)混合，混合物在 50水浴中孵育20min，然后加入 2.5mL 的 TCA(10%)终止反应，离心10min，取上清液 2.5mL，依次加入 2.5mL 无水乙醇和0.5mL FeCl3(0.1%)，混匀后于 700nm 波长处测定吸光度，蒸馏水作空白对照，VC 作阳性对照。 11.益生菌抗氧化活性及菌体抗氧化相关成分的分析.试剂: DPPH (Sigma公司)、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、FeSO4、H2O2、亚油酸EDTA、脱氧核糖、抗坏血酸、DTNB(Sigma公司)、SOD和GSH检测试剂盒(南京建成科技有限公司),其它试剂均为国产分析纯试剂。12主要仪器紫外可见分光光度计,超声波细胞粉碎机,高速低温冷冻离心机,厌氧培养箱,电热恒温培养箱,全自动高压灭菌锅,电热恒温水浴锅,无菌操作台,超纯水系统等。132菌株清除DPPH自由基能力的测定7细胞破碎液离心后取上清液10 mL,加入浓度为0