基因工程2工具酶

第二章基因工程的工具酶 第一节限制性内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节逆转录酶第五节DNA修饰酶 第一节限制性内切酶 一 寄主控制的限制与修饰现象二 II型限制性内切酶的特性三 II型限制性内切酶切割类型四 II型限制性内切酶重要概念五 限制内切酶的命名 第一节限制性内切酶定义 能够识别和切割双链DNA dsDNA 分子内特异核苷酸顺序的核酸内切酶 叫做限制性核酸内切酶 三种类型核酸内切酶特性差异 GAATTC CTTAAG 5 3 3 5 限制作用 修饰作用 GAATTC CTTAAG 5 AATTC CTTAA5 G3 3 G 5 3 3 5 3 5 5 3 EcoRI MEcoRI Me Me 核酸内切限制酶EcoRI及其修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用EcoRI识别序列经MEcoRI甲基化之后 就再不能被EcoRI所切割 一 寄主控制的限制与修饰现象 限制和修饰的作用 保护自身的DNA不受限制破坏外源DNA使之迅速降解 一般识别和切割4和6个核苷酸顺序 少数为5 7个核苷酸 也有识别8个核苷酸的 但无4个以下的 Sau3ABamH 5 G A T C A G G A T C C 3 3 C T A G T C C T A G G 5 44 25646 409648 65536 二 II型限制性内切酶的特性 4个 6个 DNA49Kb12位点 BglII6个 BamHI5个 SalI2个 1 同裂酶指来源不同但识别相同序列且切割位点相同 HindIII和HsuI 2 同位酶识别相同的序列但切割位点不一样 C C C G G GG G G C C C A A G C T TT T C G A A C C C G G GG G G C C C C C C G G GG G G C C C SmaI XmaI 四 II型限制性内切酶重要概念 3 同尾酶这一类的限制酶来源各异 识别的靶序列也不相同 但产生相同的粘性末端 G G A T C CC C T A G G BamHI T G A T C AA C T A G T BclI A G A T C TT C T A G A BglII G A T CC T A G Sau3AI U G A T C YY C T A G U XhoII U表示嘌呤 A或G Y表示嘧啶 T或C 5 G A T C3 3 C T A G 5 4 酶的星号活性当酶切条件改变时 酶的专一性可能会降低 以至于同一种酶可识别和切割多个的位点 低盐 50mM 高pH 8 高甘油浓度 EcoRI EcoRI G A A T T CC T T A A G G A A T T AC T T A A T A A A T T CT T T A A G G A G T T CC T C A A G 5 双酶切方法 同步双酶切分步双酶切 1 命名三原则取属名第一个大写字母 种名前两个小写字母取变种 品系第一个字母构成限制酶的名称在同种生物中发现几种酶 按先后顺序用罗马字母 HaemophilusinfluenzaedIII属名种名株型Hind BacillusamyloliquefaciensH淀粉液化芽胞杆菌EscherichiacoliR质粒大肠杆菌 五 限制内切酶的命名 流感嗜血菌 BamH EcoR DNA1 l 1 g buffer 10 2 lddH2O16 l限制性内切酶1 l 1u 总体积20 l A 确定酶切DNA的量B 计算完全酶切所需的酶量 C 10X反应液的体积应为终体积的1 10D 依次加入计算好的DNA量 10X反应液 酶 六 限制内切酶的反应体系 1 底物DNA1 1DNA纯度 1 1 1RNA与E结合影响有效酶浓度 1 1 2提取时混入杂质可改变识别特异性 1 2DNA浓度 DNA 过大 抑制酶活 影响酶分子扩散如 4 gDNA 1UHPa 50 l37 15h1 gDNA 1UHPa 50 l37 1h 七 影响限制性核酸内切酶反应的因素 2 识别位点及邻近位点特异性序列Xma 切点 CGGCCG 在GGCGGCCGCC时不切割 3 DNA二级 三级结构如 超螺旋DNA 病毒或质粒 比线状DNA需酶多 酶切1ug DNA 需要1 2单位的酶 酶切1ug质粒DNA 需要3 5单位的酶 4 反应系统因素 1 缓冲液 无菌 无污染 2 金属离子 3 牛血清蛋白 BSA 4 温度与反应时间 1 DNA重组2 构建载体3 DNA顺序分析4 遗传病诊断 八 限制内切酶的应用 第二节DNA连接酶 定义 能够催化双链分子中相邻的3 OH和5 P末端之间形成磷酸二酯键 使DNA分子连接起来的酶 一 种类 1 1T4 DNA连接酶 从T4噬菌体感染的大肠杆菌提取1 2大肠杆菌DNA连接酶 二 DNA连接酶的连接范围 1 粘性末端DNA连接2 缺口的填补3 平末端DNA连接 5 3 3 5 P P OH OH 5 3 3 5 P OH RNA DNA 5 3 3 5 OH OH P P Mg2 ATP Mg2 ATP Mg2 ATP T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶各种催化反应活性 三 DNA连接酶的连接条件 1 双链DNA分子2 具有3 OH和5 P3 缺口处不缺核苷酸 缺失核苷酸的裂口 丢失磷酸二酯键的缺口 3 5 连接酶封闭缺口 连接酶无法封闭缺口 无活性 a b 四 DNA连接酶的连接反应机制 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 产生一个磷酸二酯键 Amp 酶 Amp 酶 T4连接酶 ATP ppi Amp与P反应 OH P T4DNA连接酶与ATP形成酶 Amp复合物 P P A 酶 Amp复合物再结合到具5 P和3 OH切口的DNA上 使DNA腺苷化 产生一个新的磷酸二酯键 把缺口封闭起来 完成连接作用 P P P P P P P P P P P 五 T4DNA连接酶的反应条件 10 T4DNALigaseBuffer2 5 lDNA片段 约0 3pmol载体DNA 约0 03pmolT4DNALigase1 lddH2Oupto25 l反应温度16度 连接过夜 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3 10倍 指在DNA模板指导下 以4种脱氧核糖核苷酸 dNTP 为底物 在引物3 OH末端聚合DNA链的一类酶 一 种类聚合酶 pol DNA损伤修复 在半保留复制中起辅助的作用聚合酶 pol 在修复损伤中有重要的作用聚合酶 pol DNA复制过程中起主要作用聚合酶 是基因工程中的常用酶 第三节DNA聚合酶 二 DNA聚合酶的特点 1 需模板DNA 2 需引物 3 具有三种酶活性 三 DNA聚合酶的活性 1 5 3 聚合酶活性 2 5 3 外切酶活性 3 3 5 外切酶活性 裂口 缺口 四 Klenow酶 1 来源 DNA聚合酶 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶 C端 76kd N端 36kd Klenow5 3 聚合3 5 外切 5 3 外切 2 Klenow酶的三维结构 3 Klenow酶使用注意事项 1 稀释时不失活 但剧烈搅拌会失活 2 不表现切口平移活性 3 对模板高级结构的抵抗性能较好4 易发生DNA凝集作用5 用于3 粘性末端的修饰时有时会多加一个碱基 5 3 3 5 5 3 3 5 a b c d e a DNaseI处理双链的DNA分子 b 带有3 OH末端的单链缺口 c pol 从5 P移去一个核苷酸 d pol 将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸 e 重复 c d 的步骤 缺口沿5 3 方向移动 形成32P标记的核苷酸合成的DNA链 五 DNA聚合酶的应用 1 制备DNA分子杂交探针 缺口平移Nicktranslation 五 DNA聚合酶的应用 2 制备DNA分子杂交探针 随机引物法 五 DNA聚合酶的应用 3 cDNA第二条链的合成 五 DNA聚合酶的应用 4 测序 T7DNA聚合酶 Sanger双脱氧链终止法 5 3 聚合 持续反应时间最长3 5 外切 是DNA聚合酶 的1000倍 2 3 双脱氧的A C G T核苷三磷酸 称为ddATP ddCTP ddGTP ddTTP 5 1来源 水生栖热菌 Thermusaquaticus yT15 2活性 聚合最适温度为75 80 不具3 5 外切酶活性 具5 3 外切活性 五 DNA聚合酶的应用 5 PCR反应 TaqDNA聚合酶 第四节反转录酶 reversetranscriptase 一 来源 商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒 AMV 来自Moloney鼠白血病毒 M MLV 反转录酶 二 结构和活性 依赖RNA的DNA聚合酶活性 TTTT OH TTTTAGACAG AAAAUCUGUC AAAAUCUGUC 逆转录酶 Mg 4dNTP 依赖于DNA的DNA聚合酶活性 5 3 ssDNA 5 3 逆转录酶 Mg4dNTP 外切RNA酶活性 RNA酶H 寡聚RNA片段 逆转录酶 RNA DNA ssDNA RNA OH 三 用途 试剂名称使用量模板RNA1 gOligodTPrimer 50 M 或RandomPrimers 50 M 或SpecificPrimer 2 M 1 ldNTPMixture 10mMeach 1 lRNasefreedH2Oupto10 l 65 保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上 四 反转录酶的反应条件 试剂名称使用量上述模板RNA 引物等的混合液10 l5 Buffer4 lRNaseInhibitor 40U l 0 5 l反转录酶 200U l 100 200unitsRNasefreedH2Oupto20 l 42 30 60min70 保温15分钟后冰上冷却 得到第一链cDNA 一 单链核酸酶 S1 Bal31Nuclease 带切口的双链DNA 第五节DNA修饰酶 1 S1单链核酸酶的用途 1 1在cDNA合成中 切去发夹环 1 2分子克隆去 尾巴 成平末端 mRNA S1核酸酶 S1核酸酶 2 Bal31单链核酸酶的用途 2 1DNA的缺失突变 Bal31 Bal31单链核酸酶具有单链核酸内切酶和双链DNA的3 5 末端同时降解的活性 二 末端转移酶 1 来源 又称脱氧核苷酸转移酶 自牛胸腺中分离 2 活性 催化dNTP掺入DNA3 OH末端 形成同聚物末端 反应不需模板DNA 需Co2 ssDNA3 OH加尾 dsDNA3 OH加尾 包括平末端加尾 5 AACC OH 5 AACCTTTT 转移酶 Mg dTTP 5 AACC OH 3 TTGG 5 AACCTTTT 3 TTGG 转移酶 Co dTTP 3 用途 载体和DNA加上同聚 尾巴 以形成粘性末端 DNA3 OH端同位素标记 三 碱性磷酸酶与磷酸激酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 内切酶 外源基因 磷酸激酶加磷酸基 P OH OH OH