蒋宗勇母猪氧化应激与抗氧化措施ppt课件

母猪氧化应激及抗氧化措施 蒋宗勇广东省农业科学院动物科学研究所2016 3 25 报告提纲 母猪氧化应激及其危害母猪热应激及其危害大豆异黄酮对泌乳母猪生产性能和抗氧化机能的影响大豆异黄酮对猪乳腺上皮细胞生长的影响大豆异黄酮对猪乳腺上皮细胞抗氧化机能的影响 妊娠后期和泌乳期母猪体内产生大量自由基 高产母猪妊娠后期 75d到分娩 胎儿生长 71 体重 和乳腺生长 泌乳期泌乳等导致母猪营养需求旺盛 而妊娠后期限饲和泌乳期采食量和营养物质摄入不足 导致分解代谢旺盛 产生大量活性氧自由基 ROS 正常情况下 自由基与抗氧化系统保持平衡 抗氧化系统包括抗氧化剂和酶 酶包括超氧化物歧化酶 SOD 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH px 过氧化氢酶 CAT 非酶抗氧化物质包括维生素C E 胡萝卜素 尿酸和饲粮多酚类等 各种抗氧化物质和抗氧化酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力 T AOC 氧化应激 当细胞中活性氧自由基比抗氧化系统占先时 氧化应激就产生了 活性氧自由基会破坏细胞膜不饱和脂肪酸链 蛋白质的硫巯基 DNA的核酸碱基 其氧化产物分别是丙二醛 羰基化蛋白 8 羟基 2 脱氧鸟苷 为此 氧化应激的指标是总抗氧化能力 T AOC 丙二醛 MDA 羰基蛋白 8 羟基脱氧鸟苷 8 OHdG 不饱和脂肪酸 丙二醛 蛋白质 羟基化蛋白质 核酸 8 羟基脱氧鸟苷 自由基 细胞膜破坏 蛋白质变性 DNA破坏 妊娠中后期和泌乳期淋巴细胞DNA损伤严重 Berchieri RonchietalAnimal 2011 5 11 pp1774 1779 母猪体内存在系统性氧化应激 妊娠后期到泌乳期母猪血液视黄醇和a 生育酚含量显著低于妊娠早期 表明母猪体内系统性氧化应激 a 生育酚 视黄醇 Berchieri RonchietalAnimal 2011 5 11 pp1774 1779 氧化应激对母猪繁殖性能的影响血浆8 羟基 2 脱氧鸟苷 8 OHdG 水平越高 母猪产活仔数越少 YanZhao 2011 thedissertationofNorthCarolinaStateUniversity Raleigh NorthCarolina USA 氧化应激对母猪繁殖性能的影响血浆8 羟基 2 脱氧鸟苷 8 OHdG 水平越高 泌乳18天母猪背膘越薄 说明母猪体重损失越大 YanZhao 2011 thedissertationofNorthCarolinaStateUniversity Raleigh NorthCarolina USA 热应激导致母猪产生氧化应激反应血浆丙二醛MDA含量升高 YanZhao 2011 thedissertationofNorthCarolinaStateUniversity Raleigh NorthCarolina USA 正常温度 妊娠舍12 4oCto18 4oC 产房21oCto23 7oC热应激 妊娠舍23 3oCto30 3oC 产房22 1oCto30 6oC 热应激导致母猪产生氧化应激反应血浆羰基蛋白含量升高 YanZhao 2011 thedissertationofNorthCarolinaStateUniversity Raleigh NorthCarolina USA 正常温度 妊娠舍12 4oCto18 4oC 产房21oCto23 7oC热应激 妊娠舍23 3oCto30 3oC 产房22 1oCto30 6oC 热应激导致母猪产生氧化应激反应产活仔数降低 增加死胎数 正常温度 妊娠舍12 4oCto18 4oC 产房21oCto23 7oC热应激 妊娠舍23 3oCto30 3oC 产房22 1oCto30 6oC YanZhao 2011 thedissertationofNorthCarolinaStateUniversity Raleigh NorthCarolina USA 热应激导致母猪产生氧化应激反应仔猪出生窝重和18日龄窝重降低 正常温度 妊娠舍12 4oCto18 4oC 产房21oCto23 7oC热应激 妊娠舍23 3oCto30 3oC 产房22 1oCto30 6oC 热应激影响母猪繁殖性能的神经内分泌机理 母猪抗氧化措施大豆异黄酮抗氧化功能 总抗氧化能力T AOC U ml 试验1 大豆异黄酮提升泌乳母猪体内抗氧化能力 陈丰等 2010 饲料博览 8 1 大豆异黄酮提供母猪血浆过氧化氢酶活性 大豆异黄酮降低血浆丙二醛含量 b a 泌乳量 kg 大豆异黄酮提高母猪泌乳量 乳蛋白含量 乳蛋白含量 b a 陈丰等 2010 饲料博览 8 1 b a b a b a 陈丰等 2010 饲料博览 8 1 母猪大豆异黄酮提高哺乳仔猪日增重 试验2 大豆异黄酮对泌乳母猪生产性能和抗氧化机能的影响 选用227头初产长白母猪 平均231日龄 体重143公斤 在妊娠85天至哺乳 18天 期间饲料中添加0 15 30和45ppm大豆异黄酮 ISO 结果表明 大豆异黄酮对妊娠母猪的产 活 仔数 产程 产活仔窝重和初生仔猪个体重没有显著影响 对妊娠母猪血液T AOC和MDA含量无显著影响 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 大豆异黄酮显著促进母猪乳腺发育 15 45mg kg大豆异黄酮显著改善母猪妊娠110天和泌乳7天母猪的乳腺发育 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 母猪添加大豆异黄酮提高哺乳仔猪窝重 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 母猪添加大豆异黄酮提高哺乳仔猪日增重 a ab bc c Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 大豆异黄酮提高泌乳母猪血液抗氧化能力 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 大豆异黄酮提高泌乳母猪血液抗氧化酶活性 大豆异黄酮线性降低母猪血液丙二醛水平 减低泌乳母猪氧化应激 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 添加大豆异黄酮提高母猪乳汁抗氧化水平 Huetal 2015 J Anim Sci 93 2246 2254 大豆异黄酮线性降低泌乳第1 7 18天乳汁中丙二醛MDA含量 减少对仔猪的氧化威胁 试验3 大豆异黄酮对猪乳腺上皮细胞生长的影响 阳性对照组 正常的DMEM F12培养基阴性对照组 与处理组加入等量的DMSO 浓度20ug ml 大豆异黄酮 YZS 广东省农科院动物科学研究所 纯度99 异黄酮 ISO sigma公司 纯度99 采用免疫荧光法对乳腺上皮细胞中的特异表达蛋白角蛋白进行鉴定 阳性对照 阴性对照 5 M 10 M 20 M 30 M 40 M GES 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞形态的影响 1 100 大豆异黄酮YZS对细胞的促增殖作用优于同等剂量的ISO 高剂量的ISO 30 40 M 抑制细胞的增殖 大豆异黄酮促进乳腺细胞增殖 大豆异黄酮 空白对照 阴性对照 不同剂量YZS ISO对乳腺上皮细胞P cyclinE蛋白表达的影响 1 100 5 20 m大豆异黄酮促进乳腺上皮细胞P cyclinE蛋白表达 YZS的效果优于ISO 大豆异黄酮促进猪乳腺上皮细胞P cyclinE蛋白表达 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞凋亡率的影响 与阴性对照组相比 添加5 40umYZS及5 10umISO趋于降低早期细胞的凋亡比例 大豆异黄酮降低乳腺上皮细胞早期凋亡比率 阳性对照 阴性对照 YZS ISO对猪乳腺上皮细胞CyclinD1蛋白表达情况的影响 免疫荧光 图片放大倍数1 100 5 M 10 M 20 M 30 M 40 M YZS ISO 20 40 mYZS抑制CyclinD1蛋白的表达 大豆异黄酮抑制细胞凋亡相关蛋白CyclinD1的表达 阴性对照组 YZS10uM ISO10 M YZS30uM ISO30 M 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞P21蛋白表达情况的影响 免疫荧光 图片放大倍数1 100 空白对照组 与阴性对照组相比 10 30 mYZS抑制p21蛋白表达 大豆异黄酮抑制细胞凋亡相关蛋白p21的表达 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞凋亡相关蛋白表达情况的影响 10 30 MYZS ISO抑制P21蛋白的表达 且YZS效果优于ISO 10 30 mYZS促进p cyclinE蛋白的表达 抑制cyclinD1蛋白的表达 采用western blot技术进一步验证大豆异黄酮对乳腺上皮细胞的促增殖作用 YZS ISO 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞IGF 1受体基因表达水平的影响 培养24h后 10 30 mYZS提高细胞IGF I受体基因表达水平 而ISO无影响 培养48h后 10 mYZS显著提高细胞IGF I受体基因表达水平 而ISO无影响 大豆异黄酮促进乳腺上皮细胞IGF 1受体基因表达 YZS提高细胞上清液中亚精胺含量 而ISO降低亚精胺含量 YZS提高细胞上清液中组胺含量 ISO无影响 大豆异黄酮提高猪乳腺上皮上清中多胺水平 不同剂量YZS ISO对猪乳腺上皮细胞中鸟氨酸脱羧酶 ODC 基因表达的影响 培养24h后 10 20umYZS提高乳腺上皮细胞中ODC基因表达 培养48h后 10 20uMYZS提高乳腺上皮细胞中ODC基因表达 大豆异黄酮提高乳腺上皮细胞多胺合成酶基因表达 不同剂量YZS ISO对乳腺上皮细胞乳蛋白基因 casein表达水平的影响 培养24h后 10 20 mYZS提高细胞 casein基因表达水平 ISO无影响 培养48h后 10 20 mYZS显著提高细胞 casein基因表达水平 ISO无影响 大豆异黄酮促进乳腺上皮细胞乳蛋白分泌相关基因 casein的表达 不同剂量YZS ISO对乳腺上皮细胞乳蛋白基因 casein表达水平的影响 培养24h后 YZS ISO均未影响细胞 casein基因表达水平 培养48h后 10 30 mYZS显著提高细胞 casein基因表达水平 而ISO无显著影响 大豆异黄酮促进乳腺上皮细胞乳蛋白分泌相关基因 casein的表达 不同剂量YZS ISO对乳腺上皮细胞雌激素受体基因表达水平的影响 培养24h后 20 30 mISO提高雌激素受体基因ER 的表达水平 而YZS无影响 培养48h后 10 30 mISO提高雌激素受体基因ER 的表达水平 而YZS无影响 大豆异黄酮YZS不影响乳腺上皮细胞雌激素受体基因ER 表达 而ISO提高其表达 研究3 大豆异黄酮对猪乳腺上皮细胞抗氧化机能的影响 大豆异黄酮提升猪乳腺上皮细胞SOD基因表达 培养24h后 与空白对照组相比 10 MYZS显著提高细胞SOD基因表达 20 30 mISO显著降低细胞SOD基因表达 与阴性对照相比 各浓度YZS和10 mISO显著提高细胞SOD含量 48h后 与空白对照相比 20 MYZS和10 MISO显著提高细胞SOD基因表达 与阴性对照相比 各浓度YZS和20 30 mISO显著提高细胞SOD基因表达 SOD U mgprot 培养24h后 YZS或ISO均未对细胞GSH PX基因表达水平产生显著影响 培养48h后 30 mYZS显著提高细胞GSH PX基因表达 而30 mISO显著降低细胞GSH PX基因表达 大豆异黄酮提高猪乳腺上皮细胞GSH PX基因表达 GSH PX U mgprot 大豆异黄酮降低乳腺上皮细胞裂解液中MDA含量 细胞未经氧化处理时 30 MYZS显著降低细胞MDA含量 大豆异黄酮处理细胞48h后 对细胞进行氧化处理 200 MH2O2 20 30 MYZS显著降低细胞MDA产量 与阴性对照相比 各剂量YZS和ISO均显著降低细胞MDA产量 MDA含量 nmol mgprot 大豆异黄酮提高乳腺上皮细胞裂解液中总SOD活力 细胞未经氧化处理时 10 20 MYZS ISO趋于提高细胞SOD活力 YZS和ISO处理细胞48h后 对细胞进行氧化处理 200 MH2O2 后 各浓度YZS和ISO均显著提高细胞总SOD活力 其中以20 mYZS效果最突出 总SOD活力 U mgprot 大豆异黄酮提高乳腺上皮细胞裂解液中T AOC活性 细胞未经氧化处理时 10 30 MYZS趋于提高细胞T AOC活力 YZS和ISO处理细胞48h后 对细胞进行氧化处理 200 MH2O2 10 20 MYZS和30 mISO显著处理48h提高细胞T AOC活力 T AOC活性 U mgprot 结论 妊娠后期至泌乳期母猪日粮中添加大豆异黄酮显著改善母猪乳腺发育 提高母体抗氧化机能 改善后代仔猪生长性能 大豆异黄酮主要通过促进细胞增殖相关基因和蛋白表