仪和凝胶成像系统

PCR仪和凝胶成像系统 仪器分析实验 分子生物学实验技术 药学院 刘明华 内容 PCR的反应原理及反应体系PCR示例凝胶成像系统 多聚酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction KaryB Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法 此技术获得1993年诺贝尔化学奖 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶 IIIIII 拓扑异构酶解旋酶类SSB 引物dNTPMg2 模板 Mullis的PCR构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 模板 Mg2 dNTP thermusaquaticus TaqDNA多聚酶的发现 1988年Saiki等从温泉 Hotspring 中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶 Heat stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess PCR反应条件 温度三点法 温度 时间和循环次数 PCR反应条件变性使双链DNA解链为单链94 20 30秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 一般为45 65 30秒 PCR仪 3 延伸70 75 一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定 1分钟扩增1Kbp 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低错误掺入率增加 PCR的基本原理 PCR的基本原理小结 变性 复性 半保留复制 一生二 二生四 四生万物 PCR三步曲 变性90 97 退火45 65 延伸70 75 PCR过程 实时荧光定量PCR仪 梯度PCR仪 普通PCR仪 用途广泛 生命学科肿瘤遗传工程疾病诊断法医学考古学 PCR示例 一 实验目的 学习PCR分析的原理与技术 二 实验材料 仪器和试剂 1 材料 含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18 T质粒DNA2 仪器 微量移液器及吸头 PCR仪及PCR管琼脂糖凝胶电泳设备3 试剂 10XPCR反应缓冲液25mmol LMgCl210mmol LdNTP10 mol L引物1和引物2 1 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂并混匀 10XPCR反应缓冲液2 5 L25mmol LMgCl22 0 L10mmol LdNTP1 0 L10 mol L引物11 0 L10 mol L引物21 0 L质粒DNA1 0 LTaq0 1 L 5U 水补充至25 0 L 三 操作步骤 94 96 30 3 预变性 使模板充分变性 94 30 变性 45 65 30 1 复性 使引物与模板充分退火 72 n 延伸 按1 扩增1kb计算 72 3 7 总的延伸 使产物延伸完整 4 10 保存 25 35个循环 2 将反应体系放到PCR仪中扩增 PCR反应程序设置为 英国Techne多功能型PCR仪TC 412 3 反应完成后 将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀 上样电泳 PCR PCR只是一个简单的不起眼玩艺 凯利 穆利斯 KaryMullis PCR只是一个概念 所发生的奇迹是 PCR概念变成了可操作的实验系统 变成了一项成熟的技术 后者又上升成为新的概念 它最大的特点就是能不断推出新形式 摘自 MakingPCR AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow 以PCR为基础的相关技术 逆转录PCR reversetranscriptionPCR RT PCR 实时荧光定量PCR quantitativePCR 多重PCR multiplexPCR 免疫PCR差异显示PCR differentialdisplayPCR DD PCR PCR诱导定点突变原位PCR insituPCR 逆转录PCR reversetranscriptionPCR RT PCR 荧光定量PCR FQ PCR 融汇PCR技术 DNA探针杂交技术 标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团 多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计 必需保证多对引物之间不形成引物二聚体 引物与目标模板区域具有高度特异性 多重PCR multiplexPCR 原位PCR InsituPCR 原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR 对细胞中的靶DNA进行扩增 通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法 可分为直接法和间接法 基本步骤 组织切片或细胞固定 蛋白酶消化 原位PCR扩增 冲洗 产物检测优点 灵敏度高 可进行细胞内定位 锚定PCR anchoredPCR 引进锚定引物 可以克服序列未知或序列未全知的障碍 在DNA3 末端加上poly dG 尾 与此相对应的锚定引物poly dC 一般应在十二聚以上 不对称PCR asymmetricPCR 不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度 两条引物浓度比为1 50或1 100 前12个循环两条模板等量扩增 之后低浓度引物消耗殆尽 其扩增产物减少以至于无 而高浓度引物介导产生的扩增产物 即单链DNA 逐渐增加 可得到大量单链DNA ssDNA 用于直接测序 差别PCR differentialPCR 差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中 用同一套引物进行扩增 电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量 ChampChemiBasic系列全自动化学发光 荧光 可见光成像分析系统 可对各种化学发光 荧光 可见光图像进行拍摄和分析 核酸检测各种荧光染料 如EB SYBRGreen 蛋白检测考马斯亮蓝胶 银染胶以及荧光染料如SyproRed SyproOrange Pro QDiamond DeepPurple 标记胶 膜 芯片等 化学发光检测WesternLightning ECL ECLplus SuperSignal等发光底物 其他应用各种杂交膜 蛋白转印膜 培养皿菌落计数 酶标板 点杂交 蛋白芯片 TLC板 应用范围 EB染色应用于双MarkerDNA琼脂糖凝胶电泳成像 SYBRGreen荧光染料应用于DNA琼脂糖凝胶电泳的成像 考马斯亮蓝染色玉米种子蛋白质SDS PAGE电泳的凝胶成像 微孔板荧光成像 ECL发光底物检测小鼠BSA蛋白的蛋白免疫印迹 WesternBlot 的成像 SuperSignal发光底物检测WestPico底物 克隆计数 抑菌圈成像和分析 昆虫的成像和测量 分析功能 可自动识别各种电泳图像条带 自动生成峰值曲线图 自动计算分子量 条带含量 百分比 IOD值