王豪老师1乙肝病毒耐药变异的检测课件

乙肝病毒耐药变异的检测及临床意义 北京大学人民医院肝病科王豪 主要内容 乙肝病毒的活跃复制与乙肝肝硬化和肝癌密切相关 抗病毒治疗是控制乙肝的有效治疗核苷类药物的主要临床效果与耐药发生病毒耐药的主要检测方法病毒耐药的临床意义与防治对策 HBVDNA高负荷是肝癌发生的重要相关因素 台湾队列研究 3851例HBsAg阳性者经13年隨访 ChenCJ JHepatol2005 42 16 A35 11年前HBVDNA水平 11年后肝硬化发生率 36 2 106 104 105 23 5 103 104 300 103 9 8 300 5 9 4 5 1991 1992年台湾3582例没有治疗的HBV患者进行平均11年随访研究 HBVDNA 肝硬化 慢性乙肝的抗病毒治疗 对于慢性乙肝 抗病毒治疗已成为最主要和最有效的治疗 国内外的慢性乙肝防治指南均推荐实行抗病毒治疗 抗乙肝病毒治疗药物 第一类 a干扰素 包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素 主要药理作用是直接抑制病毒复制和增强机体免疫功能 第二类 核苷 酸 类药物 抑制病毒DNA聚合酶和逆转录酶 NA IFN LVD FTC LdT Clevudine ETV L 核苷 无环磷酸盐化合物 环戊烷 烯 抗HBV核苷类药物的分类 核苷 酸 类药物的分类 左旋核苷类 拉米夫定 替比夫定环戊烷 烯 类 恩替卡韦无环磷酸盐类 核苷酸类 阿德福韦替诺福韦 一年抗病毒治疗HBVDNA测不出比率 HBeAg阳性病例 HBeAg阴性病例 一年抗病毒治疗ALT复常率 HBeAg阳性病例 HBeAg阴性病例 一年抗病毒治疗HBeAg血清转换率 一年抗病毒治疗HBsAg血清转换率 5 10 3 0 0 0 0 0 pegIFN LVD ADV L dt ETV TDV 乙肝病毒的耐药现象 病毒的基因突变导致耐药耐药导致疗效降低或丧失 病毒的自发突变导致耐药株出现 病毒颗粒的高复制率 1012 13个病毒颗粒 天自发突变的高发生率 HBV逆转录酶缺乏纠错功能 10 5置换 碱基 循环每天每个碱基位置上都可能发生突变治疗前耐药突变株可能已存在 HBV耐药株如何成为优势株 适者生存 在抗病毒治疗过程中 对药物不敏感而具有生存优势的变异株成为成为优势株 核苷类药物的耐药机制 病毒每日每时都在发生各种突变 包括对核苷类药物的耐药突变 但一般而言 突变株病毒复制能力弱于野生株 因此未用过核苷类药物的病人总是野生株占优势 在应用核苷类药物后 敏感的野生株受到药物的强烈抑制 逐渐减少消失 而自发出现的耐药变异株不受药物抑制 逐渐增多成为优势株 因此核苷类药物对耐药株病毒起到了选择作用 而不是诱导突变的作用 核苷类药物的耐药机制 StephenLLocarnini等分析 HIV的抗病毒治疗也会导致病毒耐药 这是人们早就熟知的问题 但相比较而言 HBV发生耐药变异的速度要慢很多 拉米夫定治疗乙肝一年的耐药率约20 而拉米夫定治疗HIV时 最快1周就可能发生耐药突变 JosephJSasadeusz StephenLLocarnini GraemeMacdonaldMJA2007 186 204 核苷类药物治疗核苷初治患者耐药发生率 基因型耐药或耐药导致的病毒学反弹 拉米夫定 阿德福韦 恩替卡韦为基因型耐药发生率 替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率 1 2 核苷 酸 类药物治疗后病毒耐药的检测 检测病毒耐药变异的最常用的方法有 直接测序法限制性片段长度多态性分析法线性探针反向杂交法基因芯片法 DNA序列分析法 对病毒全基因或P基因进行PCR扩增将PCR产物制备克隆挑选一定数量的克隆测序 扩增目的基因 PCR产物 变异株 野生株 PCR产物克隆 PCR产物克隆序列分析 每例标本20 25个克隆 直接序列分析的优缺点 可以发现新的变异位点 包括已上市药物的新的变异位点和新药的变异位点 2 灵敏度低 只有当变异株数量超过DNA总量的20 时才能测出 3 选取克隆数量少时容易出现误差 限制性片段长度多态性分析法RestrictionFragmentLengthPolymorphism 提取总HBVDNA 扩增P基因突变区的DNA序列 用错配引物对上述PCR产物进行第二次扩增 目的是引入酶切位点 3 用限制性内切酶进行酶切分析 野生株和变异株因引入酶切位点的不同 在酶切后表现为不同的分子长度片段 电泳时出现不同的条带 以此诊断野生株或是变异株 野生株序列 TATATG736737738739740741 TATGTG736737738739740741 YVDD变异序列 TATATT736737738739740741 YIDD变异序列 NdeI酶切位点 CATATG736737738739740741 孙剑等第一军医大学学报1999 6 489 492 引入酶切引物后的序列 CATATG736737738739740741 野生株 NdeI CATGTG736737738739740741 YVDD变异株 NdeI YIDD变异株 CATATT736737738739740741 NdeI 短片段 长片段 长片段 孙剑等第一军医大学学报1999 6 489 492 分子量标记2 野生株阳性对照3 野生株4 混合变异5 变异株6 变异株 孙剑等第一军医大学学报1999 6 489 492 11589 RFLP方法的优缺点 灵敏度高 能检出低至5 的变异株 方法简便易行 只能检出已知位点 不能发现新位点 并非所有的变异位点都能使用RFLP法 因为有些变异不存在特异性的酶切位点 5 有些突变破坏了限制性内切酶位点 导致内切酶失败6 酶反应条件的限制导致有些突变不能酶切 线性探针反向杂交法 INNO LIPAHBVDRv1 2 3 将反向杂交探针包被于检测条上 扩增标本HBVDNA P区 A F 将PCR产物与检测条上的探针杂交 显色 阅读结果 INNO LIPAHBVDR 第一代产品 检测LAM变异的180和204位点 第二代产品 180 204 80 173 LAM 181 236 ADV 第三代产品 两个检测条 第一条是v 2 第二个条是检测ETV变异和TDV变异 并加入了ADV原发无应答的变异 针对不同的药物 不同的变异位点 不同的变异方式 不同的基因型 共包被有54条探针 检出11个位点变异 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 线性探针反向杂交法优缺点 灵敏度高 可检出5 的变异株 商品化试剂 操作方便快捷 结果稳定准确 只能检出已知位点 发现新位点后必须增加新探针 因为病毒有多种基因型 一个位点的突变 可能需要多个探针 最终为了检出所有突变 需要大量不同的探针 6 商品试剂盒价格昂贵 基因芯片法 同线性探针反向杂交方法类似 基因芯片又称基因微矩阵 microarray 它是将大量特定的基因片段 寡核苷酸片段 作为探针有序地 高密度地排列在固定载体上 然后与待测标本进行杂交 最后显色 阅读结果 基因芯片检测模式 单万水等全国第2届中西医结合传染病学术会议论文汇编 2008 病毒耐药变异检测的临床意义 治疗开始前的耐药病毒检测可以帮助选择初治药物 2 治疗后的耐药监测有助于及时采取挽救治疗措施 3 根据耐药变异位点的不同选择合适的药物 乙肝病毒耐药位点 拉米夫定 L80IV173LL180MM204IM204V恩替卡韦 V173LL180MA184GS202IM204IM204VM250V替比夫定M204I阿德福韦 A181VN236T替诺福韦 A194TFTC M204IM204V阿德福韦原发耐药 I233V 与耐药相关的病毒变异 LAMETVLdTFTCADVTDV L80IV173LL180MA181VA184GA194TS202IM204IM204VN236TM250V I233V I233V ADV原发无应答 注 核苷 酸 类药物耐药后挽救治疗方案 LokASF McMahonBJ AASLDPracticeGuideline2009Hepatology2009 拉米夫定耐药的处理 优先选择 拉米夫定 阿德福韦酯联合治疗次选1 恩替卡韦1mg 倍量 次选2 替诺福韦300mg次选3 替比夫定 阿德福韦酯联合治疗次选4 恩替卡韦0 5mg 阿德福韦酯次选5 替比夫定 经耐药位点测定为YVDD变异 不宜选择 单用阿德福韦酯不宜选择 恩替卡韦0 5mg或替比夫定 替比夫定耐药的处理 优先选择 替比夫定 阿德福韦酯联合治疗次选1 恩替卡韦1mg 倍量 次选2 替诺福韦300mg次选3 恩替卡韦0 5mg 阿德福韦酯不宜选择 单用阿德福韦酯不宜选择 恩替卡韦0 5mg或拉米夫定 阿德福韦酯耐药的处理 优先选择 恩替卡韦或替比夫定次选1 阿德福韦酯 拉米夫定次选2 拉米夫定次选3 恩替卡韦