05-基因工程第二章.ppt

第二章基因工程的工具酶 第一节限制性核酸内切酶一 限制性核酸内切酶的发现 有关的几个概念 限制 restriction 修饰 modification 宿主控制性限制 host controlledrestriction 限制性核酸内切酶的生物学功能 Restrictionendonucleases Restriction modificationsystemsoccurinmanybacterialspecies andconstituteadefensemechanismagainsttheintroductionofforeignDNAintothecell Theyconsistoftwocomponents thefirstisarestrictionendonuclease whichrecognizesashort symmetricalDNAsequence andcuts hydrolyzes theDNAbackboneineachstrandataspecificsitewithinthatsequence ForeignDNAwillhencebedegradedtorelativelyshortfragments Thesecondcomponentofthesystemisamethylase whichaddsamethylgrouptoaCorAbasewithinthesamerecognitionsequencesinthecellularDNA ThismodificationrendersthehostDNAresistanttodegradationbytheendonuclease Restrictionendonucleases Restrictionendonucleasesarebacterialenzymeswhichcut hydrolyze DNAintodefinedandreproduciblefragments Inbacteria theyformpartoftherestriction modificationdefensemechanismagainstforeignDNA Theyarethebasictoolsofgenecloning 二 限制性核酸内切酶的分类 核酸酶核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 核酸外切酶 exonuclease 核酸内切酶 endonuclease 二 限制性核酸内切酶的分类 1 型限制性核酸内切酶类型I限制性内切酶属于复合核酸酶 既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性Messelson YuanEcoKEcoB T G A N8 T G C T5 TGA NNNNNNNNTGCT 3 3 ACTMMMMMMMA CGA 5 约1000bp切割 2 型限制性核酸内切酶 1 一般性质一般是37 Hae 70 Sam 25 Taq 65 牛血清白蛋白 BSA 和二硫苏糖醇 DTT 1单位酶活性 1unit1U 星活性 staractivity EcoR 2 型酶的识别与切割顺序II型酶的识别序列一般是4 6个碱基 也有6个以上的 但没有4个以下的 这些序列具有双重螺旋对称的结构形式 换言之 这些核苷酸对的顺序是呈回文结构 EcoR 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 平末端 blunt flushend termini Hae 5 GGCC 3 5 GGCC 3 3 CCGG 5 3 CCGG 5 Sma 5 CCCGGG 3 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 3 GGGCCC 5 5 粘性末端 sticky cohesiveend termini EcoR 5 GAATTC 3 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 3 CTTAAG 5 3 粘性末端 Pst 5 CTGCAG 3 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 3 GACGTC 5 Cohesiveends Thoseproductsofrestrictionenzymedigestionwithprotrudingendshaveafurtherproperty theseendsareknownascohesive or sticky ends sincetheycanbindtoanyotherendwiththesameoverhangingsequence bybasepairing annealing ofthesingle strandedtails Hence forexample anyfragmentformedbyanEcoRIcutcanannealtoanyotherfragmentformedinthesamewayandmaysubsequentlybejoinedcovalentlybyligation Infact insomecases DNAendsformedbyenzymeswithdifferentrecognitionsequencesmaybecompatible providedthesingle strandedtailscanbase pairtogether Cohesiveend Restrictionenzymeproductswithsingle strandedterminiaresaidtohavecohesiveor sticky end sincetheycanannealbybasepairingtoanyotherfragmentwithacomplementaryterminus Recognitionsequences Theactionofrestrictionendonucleases restrictionenzymesforshort isillustratedinFig 1aincludingthearchetypalenzymeEcoRIasanexample Thisenzyme whichactsasadimer willonlyrecognizea6bppalindromicsequence thesequenceisthesame reading5 3 oneachstrand TheproductofthecuttingreactionatthissiteonalinearDNAistwodouble strandedfragments restrictionfragments eachwithanidenticalprotrudingsingle stranded5 endwithphosphategroupattached The3 endshavefreehydroxylgroups A6bprecognitionsequencewilloccuronaverageevery46 4096bpinrandomsequenceDNA hence averylargeDNAmoleculewillbecutintospecificfragmentsaveraging4kbbysuchanenzyme Hundredsofrestrictionenzymesarenowknown andalargenumberarecommerciallyavailable Theyrecognizesitesranginginsizefrom4to8bpormore andmaygiveproductswithprotruding5 or 3 tailsorbluntends Thenewlyformed5 endsalwaysretainthephosphategroups TheextremelyhighspecificityofrestrictionenzymesfortheirsitesofactionallowslargeDNAmoleculesandvectorstobecutreproduciblyintodefinedfragments 3 型限制性内切酶的一些特点 识别及酶切位点相同 Hind A AGCTTHsu A AGCTT 识别位点相同但酶切位点不同 Sma CCC GGGXma C CCGGG 酶切位点不同但产生相同的粘性末端 BamH G GATCCBgl A GATCTBcl T GATCASau3A GATC BamH Bcl 5 GGATCA 3 3 CCTAGT 5 连接5 GGATCA 3 3 CCTAGT 5 4 酶切位点的计算 四核苷酸识别序列 44 256用Bgl A GATCT 酶切 DNA 49Kb 46 409649000 4096 12 3 III型限制性内切酶 Bga 5 GACGC 3 5 CATGACGCAGAAGTTAACAC3 3 GTACTGCGTCTTCAATTGTG5 2365 ACTGACGCGTTGGATGAGGA3 3 TGACTGCGCAACCTACTCCT5 11495 ATGGACGCGCGTTGGCGCTCT3 3 TACCTGCGCGCAACCGCGAGA5 三 限制性核酸内切酶的命名 1973年史密斯 H Smith 和纳桑斯 D Nathans 提议 每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表 第一个字母采用细菌属名的第一个字母 第二和第三个字母小写 采用细菌种名的前两个字母 如大肠杆菌 Escherichiacoli 用Eco表示 而Hae代表从细菌 Haemophilusaegypticus 中分离出的限制性内切酶 第四个字母表示菌株 不一定大写 的类型 如EcoR中的R代表大肠杆菌R株 如果一个菌株有几种限制酶 则在代表菌株的字母后用罗马数字表示 如 流感嗜血d株的三种限制酶 Haemophilusinfluenzae HindI HindII HindIII表示 自己写 BaciUusamyloliquefaciensHStreptomycesalbusI 第二节DNA分子片段化 一 天然DNA的制备 1 天然DNA的来源 染色体DNA 染色体DNA是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料 病毒和噬菌体DNA 主要用于构建基因克隆载体 承载较大片段的外源DNA 经体外包装 导入受体细胞 质粒DNA 主要用于构建基因克隆载体 线粒体和叶绿体DNA 这是真核生物特有的染色体外遗传物质 这些DNA被用产分离目的基因和基因表达调控因子 也有可能用来构建基因克隆载体 2 天然DNA的提取 准备生物材料 裂解细胞 对细胞结构简单的原核生物 可用溶菌酶处理 用NaOH和SDS处理 用煮沸处理 用冰冻处理 以及用超声波处理等方法使细胞裂解 对结构复杂的动物 植物材料 首先必须将其粉碎 为此可采用液氮冻结后研磨 或用捣碎机 研钵直接粉碎 随后再参照裂解原核生物细胞的方法裂解细胞 分离和抽提DNA 酚 氯仿 异成醇或氯仿 异戊醇等有机溶液 可使DNA与蛋白质分开 然后用乙醇或异丙醇处理含DNA的水相 使其沉淀 离心获得DNA 问题 异戊醇的作用 异戊醇的作用 是消泡 并使蛋白质层紧密 使水相和有机相分层较好 二 DNA的纯化 琼脂糖凝胶电泳洗脱法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收 DNA样品在琼脂糖凝胶上电泳分带后切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块装入透析袋透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液并且置于稀释的电泳缓冲液中电泳1 2h 使DNA脱离琼脂糖凝胶再反向电泳30s lmin 使附着在透析膜上的DNA重新进人缓冲液中吸取透析袋的洗脱液置于离心管中离心 转移上清液到另一离心管中 加入NaAc再加入2体积无水乙醇 20 放置1 5min以上 4 下以12000r min离心20min 弃去上清液 沉淀在空气中晾干 溶于适量TE缓冲液中 去掉插入DNA中的EB 正丁醇 或异戊醇 抽提法向DNA样品溶液中加入等体积用溶解DNA的缓冲液饱和的正丁醇 轻轻混合 待上下相液体分开后 弃去上相正丁醇 重复以上步骤至少一次 直至上相正丁醇无桔红色 ExtractionofEBwithn butanol 三 DNA的浓缩 乙醇沉淀法在含一价阳离子的DNA溶液中加入2体积的无水乙醇 使DNA沉淀 20 时间在30min以上 通过离心收集沉淀的DNA再溶于适量的TE缓冲液或无菌水中 四 限制性核酸内切酶反应 1 限制性核酸内切酶反应缓冲液 2 单酶切法 若DNA样品是环状DNA分子 完全酶切后 产生与识别序列数 n 相同的DNA片段数 并且DNA片段的两末端相同若DNA样品本来就是线形DNA片段 完全酶切的结果 产生n 1个DNA片段数 其中有两个片段的一端仍保留原来的末端 单酶切步骤 在一只Eppendorf离心管中依次加入13 l无菌重蒸水 2 l10X反应缓冲液 4 l底物DNA和lU限制性核酸内切酶液 总体积为20 l充分摇匀 离心2s 集中反应液 在最适反应温度下保温l 3h 最后升温使酶失活 置于65 水浴中保温10 15min 可使酶失活 采用乙醇沉淀处理 除去酶蛋白 3 双酶切法 应先用需要较低盐浓度缓冲液的酶进行切割 然后调节缓冲液的盐浓度 再加入需要较高盐浓度缓冲液的酶进行切割 如果两种限制性核酸内切酶的最适反应温度不同 则应先用最适反应温度较低的酶进行切割 升温后再加入第二种酶进行切割 若两种限制性核酸内切酶的反应系统相差很大 会明显影响双酶切结果 则可以在第一种酶切割后 经过凝胶电泳回收需要的DNA片段 再选用合适的反应系统 进行第二种限制性核酸内切酶的切割 4 部分酶切 根据DNA重组设计的需要 专门创造部分酶切的条件 可以获得需要的DNA片段 当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNA分子上有多个识别序列 并且其中一个识别序列正好在切割后需要回收待用的DNA片段上 若完全酶切 势必将此待用的DNA片段从中切断 在此情况下 对DNA样品进行部分酶切 经过凝胶电泳 根据待用DNA片段的大小 可回收待用的DNA片段 4 部分酶切 部分酶切指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别列进行不完全的切割 部分酶切会得到任意切点的组合片段 5 DNA分子的限制性图谱 当一种DNA的核苷酸序列被全部测定后 意味着此DNA分子上所有的限制性核酸内切酶识别序列也已经全部知道 可以绘制出DNA分子上每种限制性核酸内切酶的识别序列的分布图 这样的图为限制性图谱 restrictionmap 或称为物理图谱 phsicalmap 部分酶切 1 2kb1 5kb2 0kb0 7kb EcoR EcoR EcoR 五 影响核酸内切限制酶活性的因素 1 DNA的纯度 增加核酸内切限制酶的用量 平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些 扩大酶催化反应的体积 以使潜在的抑制因素被相应地稀释 延长酶催化反应的保温时间 2 DNA的甲基化程度甲基化酶 一种是dam甲基化酶 催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化 另一种是dcm甲基化酶 催化CCA TGG序列中内部的胞嘧啶的残基甲基化 3 酶切消化反应的温度 4 DNA的分子结构某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量 要比消化线性DNA的高出许多倍 最高的可达20倍 5 核酸内切限制酶的缓冲液 第三节DNA聚合酶 一 DNA聚合酶概述1 DNA聚合酶 polymerase 的概念2 DNA聚合酶的分类 根据模板及作用方式的不同 1 间断 discontinuity 在DNA的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂 相关的概念 2 缺刻 nick 某一位置上丢失了一个或几个核苷酸 1 以DNA聚合酶I为代表的 合成型 2 以klenow聚合酶为代表 只有聚合酶活性和部分外切酶的活性 3 逆转录酶类 以RNA作为聚合模板 DNA聚合酶 1 大肠杆菌DNA聚合酶I 全酶 2 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 Klenow片段 3 T4噬菌体DNA聚合酶4 T7噬菌体DNA聚合酶5 TaqDNA聚合酶6 逆转录酶 依赖于RNA的DNA聚合酶 reversetranscriptase 7 未端转移酶 二 大肠杆菌DNA聚合酶I 全酶 1 性质 DNA聚合酶I的分子量为109KD 是一条约1000个氨基酸残基的多肽链 5 3 DNA聚合酶活性 能以单链DNA为模板 在3 OH引物的引导下 按5 3 方向 合成互补的DNA序列 3 5 外切核酸酶活性 能够去除延长的核酸链上的3 OH末端上的核苷酸 可以沿3 5 方向降解双链或单链DNA 释放5 单核苷酸 5 3 外切核酸酶活性 能从DNA链5 P末端降解双螺旋DNA的一条链 活性特点 2 用途 用切口平移 缺口转移 方法标记DNA 在所有聚合酶中只有大肠杆菌DNA聚合酶I能用于此反应 因为它具有5 3 外切核酸酶活性 可以在聚合酶沿DNA链推进之前 从DNA链上去除核苷酸 三 大肠杆菌DNA聚合酶I大片段 Klenow片段 1 性质目前 作为商品提供的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生 通过克隆技术而到的单一多肽 分子量是71KD 它具有5 3 聚合活性和3 5 外切酶活性 2 用途 1 补平限制酶切割DNA产生的3 凹端 在许多情况下 用限制酶消化DNA及随后用klenow片段补平3 凹端 2 用 32P dNTP补平3 凹端 对DNA片段进行末端标记 四 T4噬菌体DNA聚合酶 1 性质T4噬菌体