蛋白酶活性检验方法.docx

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo42H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g、水700mL、85磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、3 三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。2、2、5 盐酸溶液c（HCI）1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（PH7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO412H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b、乳酸缓冲液（PH3.0）适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸（8090）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取乳酸钠（70）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液（PH10.5）适用于碱性蛋白酶甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。2、2、7 10g/L酪素3）溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注：3）酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2、28 100ug/mL L酪氨酸4）标准溶液a、称取预先于105干燥至恒重的L酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。注：4）L酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L酪氨酸标准溶液。2、3 仪器和设备2、3、1 恒温水浴 400.2。2、3、2 分光光度计 应符合GB9721的规定。2、4 分析步骤4、1 标准曲线的绘制a、L酪氨酸标准溶液按表3配制表3管 号酪氨酸标准溶液的浓度ug/ mL取100ug/ mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b、分别取上述溶液各1.00 mL（须做平等试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL，置于400.2水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。其K值应在95100范围内。4、2 测定（1）待测酶液的制备a、称取酶粉12g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00 mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.250.40范围内）。b、酶粉测定时，稀释倍数参考表A4（液体酶亦可参照表A4稀释）。表A4酶活单位总倍数第一次稀释第一次稀释2万20002g 200 mL（100倍）5 mL 100 mL（20倍）3万25002g 500 mL（100倍）5 mL 50 mL（10倍）4万40002g 200 mL（100倍）5 mL 200 mL（40倍）5万50002g 500 mL（100倍）5 mL 100 mL（20倍）9、10万100002g 500 mL（100倍）5 mL 200 mL（40倍）（2）测定a、先将酷素溶液放入400.2恒温水浴中，预热5min；b、按下列程序操作：试管A（空白） 试管B（酶试样，需作三个平行试样）加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL400.2，2min加三氯乙酸2.00 mL（摇匀） 加酪素1.00mL（摇匀）400.2，10min 400.2，10min加酪素1.00（摇匀） 加三氯乙酸2.00mL（摇匀）取出静止10min，过滤 取出静止10min，过滤取1.00mL滤液 取1.00mL滤液加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL加福林试剂使用液1.00mL 加福林试剂使用液1.00mL400.2 显色20min 400.2 显色20min于680nm波长，用10mm比色皿 于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度 测其吸光度c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为300.2外，其它操作同 4、2（2）。标准曲线作同样处理。5 计算XAK4/10n2/5AKn（A3）式中：X样品的酶活力，u/g（u/mL）；A样品平行试验的平均吸光度；K吸光常数；4反应试剂的总体积，mL；10反应时间10min，以1min计；n稀释倍数。所得结果表示至整数。6 结果的允许差平行试验相对误差不得超过3。紫外分光光度法（第二法）1 原理蛋白酶在一定的温度与PH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。2 试剂和溶液同 2。3 仪器和设备3、1 恒温水浴400.2。3、2 紫外分光光度计 应符合GB 9721的规定。4 分析步骤4、1 求K值按第一法（ 4、1a）的表A3配制不同浓度的L酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计测定其吸光度（A），并计算K值（其K值应在130135）范围内）。4、2 待测酶液的制备a、称取酶粉12g，精确至0.0002g（或吸取酶液1.00 mL）,以下操作同A242中(1)a；b、测定酶粉时稀释倍数参考表A5（液体酶亦可参照表A5稀释）。表A5酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释25万810万200040001g 200mL（200倍）1g 200mL（200倍）10mL 100mL（10倍）5mL 100mL（20倍）4、3 测定除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三氯乙酸吸取4.00 mL外，其它操作条件同福林法测定（ 4、2）中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。5 计算XAK8/21/10n2/5AKnE（A