蛋白酶酶活测定方法(福林法).doc

蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。3.6 缓冲溶液a磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液 称取乳酸（80%90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液 取甲液8mL，乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。c硼酸缓冲溶液（pH=10.5），适用于碱性蛋白酶。甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液 取甲液500mL，乙液400mL，混匀，用水稀释至1000mL。3.7 10g/l酪素溶液 称取酪素10.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴）湿润后，加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入1000mL容量瓶，用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。3.8 100g/mL L-酪氨酸标准溶液a称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，准确至0.0002g，用1 mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/l盐酸定容至100mL，即得100g/mL L-酪氨酸标准溶液。4仪器和设备4.1 恒温水浴 400.2。4.2分光光度计 应符合GB9721的规定。5 分析步骤5.1 标准曲线的绘制aL-酪氨酸标准溶液：按表A3配制。表A3管号酪氨酸标准溶液的浓度g/mL取100g/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于400.2水浴中显色20min，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（g），既为吸光度常数K值。其K值应在95100范围内。5.2 测定（1）待测酶液的制备 a.称取酶粉12g，精确至0.0002g（或取液体酶1.00mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒搅拌捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研34次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.250.40范围内）。b.酶粉测定时，稀释倍数参考表4（液体酶液可参照表4稀释）。表4酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释2万20002g200mL（100倍）5mL100mL（20倍）3万25002g500mL（250倍）5mL50mL（10倍）4万40002g200mL（100倍）5mL200mL（40倍）5万8、10万5000100002g500mL（250倍）2g500mL（250倍）5mL100mL（20倍）5mL200mL（40倍）（2）测定a 先将酪素溶液放入400.2恒温水浴中，预热5min。b 按下列程序操作于660nm波长，用10mm比色皿测其吸光度 c. 1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为300.2外，其他操作同5.2，标准曲线也作同样处理。5.3 计算X=AK4/10n=2/5AKn式中，X样品的酶活力，u /g（u/mL）；A样品平行试验的平均吸光度；K吸光常数 (K=97.09实验室测定值)4反应试剂的总体积，mL；10反应时间10min，以1min计；n稀释倍数5.4 结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%。需要准备的：麸皮，面粉，水，纱布，福林试剂，250ml三角瓶，每组1015支试管，分光光度计，三氯乙酸，磷酸缓冲液或水，碳酸钠溶液，酪素，已传代好的试管斜面。最好能镜检一下真菌菌丝的形态。试管A（空白）加酶液1.00ml40+0.2, 预热2min加三氯乙酸2.00ml摇匀40+0.2, 保温10min加酪素1.00ml,摇匀取出静置10min,过滤 取1.00ml滤液加碳酸钠溶液5.00ml加福林试剂使用液1.00 ml40+0.2,显色20min试管B（酶