苹果酸-乳酸酶基因克隆 及其在酿酒酵母中的表达.doc

Oenococcus oeni苹果酸乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达*中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):5055刘延琳1蒋思欣2何秀萍2李华1张博润2*（1 西北农林科技大学葡萄酒学院杨凌7121002 中国科学院微生物研究所北京100080）摘要苹果酸乳酸酶是苹果酸乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上, 以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以大肠杆菌酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中, SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L苹果酸转化成L乳酸，L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，苹果酸的相对降低率平均为20.95%。 在有选择压力条件下，重组质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。关键词酒酒球菌苹果酸乳酸酶基因转化表达收稿日期：20050802修回日期：20050909*陕西省自然科学基金及西北农林科技大学青年学术骨干支持计划资助项目* 通讯作者，电子信箱：葡萄酒的酿造包含酒精发酵和苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation, MLF）两个生化过程,分别由酵母菌和乳酸菌在不同条件下完成。由于葡萄酒乳酸菌是在高酒精含量、低pH值及存在有SO2的环境中生长繁殖，MLF的过程往往比较缓慢，常出现迟滞现象，甚至引发微生物病害13。如果能把乳酸菌参与MLF过程的基因通过遗传转化导入酵母菌中，使酒精发酵和MLF由重组酵母单独完成，则可减少细菌引发的葡萄酒酸败，避免乳酸菌在MLF过程中产生不必要的代谢副产物，缩短葡萄酒的酿造周期。苹果酸乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）是MLF过程中降解苹果酸的功能酶1,3。不同来源的苹果酸乳酸酶基因在酿酒酵母表达研究311取得了一些进展。酒酒球菌（Oenococcus oeni）是优良的葡萄酒乳酸菌，关于O. oeni苹果酸乳酸酶基因（mleA）的克隆及转换酿酒酵母的研究报道只有1例3，且表达的效率较低。本研究进行我国自行筛选的优良酒酒球菌菌系SD2a的mleA基因的重组表达质粒的构建及其在酿酒酵母中的转化和表达，进一步探索提高酿酒酵母重组菌株降酸效率的途径。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒大肠杆菌DH5、酿酒酵母YS58（MAT,ura3，trp1，leu2，his4）、质粒YEp352（amp，URA3，YeastE.coli穿梭载体）、pVC7276、pEA1（YEp352：TADHI，何秀萍构建）、pLmleA（YEp352：mleA，刘延琳构建），均由作者所在实验室保存。1.1.2工具酶、抗生素及试剂RNase购自华美生物工程公司； T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术发展中心。分析纯L苹果酸购自北京化学试剂公司，色谱纯L苹果酸和L乳酸均购自Sigma公司。1.1.3培养基及培养条件 大肠杆菌DH5保存和培养用LB培养基，加入氨苄青霉素、IPTG和Xgal的LB培养基用于筛选重组转化子12，37静置或振荡培养；酿酒酵母完全培养基为YEPD培养基，转化子用含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的YNB选择培养基13进行筛选鉴定，28静置或振荡培养。1.1.4引物根据已发表的酒球菌mleA基因的核苷酸序列3，设计相应的寡核苷酸引物P1/P2进行目的基因的PCR鉴定。下划线处分别是引入的EcoRI和KpnI酶切位点。P1：5CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGTAT3;P2：5TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT3；以上引物均委托上海生工公司合成。2005, 25(12)刘延琳 等：Oenococcus oeni苹果酸乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 20051.2方法1.2.1基因操作质粒抽提、酶切反应、DNA片段回收、连接反应、细菌转化等操作均参照“分子克隆”第3版12略加修改。1.2.2重组表达质粒的PCR鉴定分别以重组表达质粒及其菌液为模板，用Taq酶进行PCR反应，验证重组表达质粒的正确性。反应条件：94/5min；94/ 40s，56/2min，72/3min，共29次循环；72/ 15min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。1.2.3酵母转化及转化子筛选酵母转化采用醋酸锂转化法13，转化子用SD/Ura（含有色氨酸、亮氨酸、组氨酸的YNB）平板筛选。1.2.4酵母转化子鉴定参照文献13进行转化子的营养缺陷型鉴定。参照文献14,15进行转化子的交配型鉴定。参照文献12进行酵母转化子的PCR鉴定。1.2.5DNA斑点杂交鉴定提取酵母转化子的基因组DNA，参照文献12进行。1.2.6SDSPAGE检测参照文献12进行。1.2.7酵母转化子的功能检测将转化子以相同的接种量接于添加了6.5g/L L苹果酸的YEPD培养基中，28振荡培养5d，取上清，用高效液相色谱（HPLC）检测L苹果酸和L乳酸含量。1.2.8重组质粒的遗传稳定性检测参照文献14,15进行。2结果与讨论2.1mleA基因重组表达质粒的构建前期研究对O.oeni SD2a的mleA基因进行了克隆测序16,17，所得包含mleA基因的重组质粒命名为pLmleA。用EcoRI和KpnI双酶切的质粒pLmleA，用低熔点琼脂糖回收目的基因片段，与来源于pVC7276的PGK1启动子和来源于pEA1的ADH1终止子连接，共同插入穿梭质粒YEp352，构建了重组表达质粒pYELmleA（图1）。图1mleA基因重组质粒和重组表达质粒的构建Fig.1Construction of the recombinant plasmid and recombinant expressing plasmid of mleA通过Amp抗性筛选及a互补（蓝白筛选）获得单菌落，进行质粒快速抽提、质粒碱提、酶切等验证，获得重组表达质粒pYELmleA。以pYELmleA的阳性克隆为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增，得到了约1.6kb的特异性片段（图2），与mleA基因的大小相符。回收PCR扩增片段，用EcoRV进行酶切，得到约0.4kb和1.2kb的两个片段，用PvuII酶切，得到约0.6kb和1.0kb的两个片段（图3），结果同目的基因的酶切位点相符17，证明插入的目的基因片段正确，pYELmleA的构建正确。图2重组表达质粒的菌落PCR验证Fig. 2Verified of transformants by colony PCRM：DGL2000 Marker；16：Result of colony PCR图3PCR扩建产物的酶切分析Fig.3Verified with restriction enzymedigestion of PCR productM:DGL2000 Marker;1:EcoRV;2.Pvu2.2酵母转化及转化子鉴定将重组表达质粒及空载体YEp352分别转化酿酒酵母YS58，转化子用SD/Ura培养基平板上筛选。获得的重组转化子YSA进行PCR鉴定，得到了预期的目的基因片段（图略）。获得的重组转化子进而进行交配型和营养缺陷型鉴定, 结果重组转化子与受体菌同是交配型（表1）。由于重组转化子弥补了受体菌的尿嘧啶缺陷, 因而可在SD/Ura培养基平板上生长（表1）。表1酵母转化子营养缺陷型和交配型鉴定Table 1Mating type and auxotrophic test of yeast transformants菌株Mating type testAuxotrophic testaSD/Ura YNB+Leu+Trp+His受体菌YS58+空载体转化子YS352+重组表达质粒转化子YSA+2.3酵母转化子的斑点杂交检测分别提取酵母转化子YSA 和YS352（CK）的质粒DNA，以回收的mleA基因为探针，进行斑点杂交检测。杂交结果（图4）显示，标记的探针与O.oeni SD2a的总DNA及重组转化子的质粒DNA有明显的杂交信号，而与宿主菌YS58及空载体转化子DNA没有可见的杂交信号，说明得到的重组酵母转化子是阳性转化子。图4点杂交结果Fig.4Results of dot bloting hybridization1：O.oeni SD2a tatal DNA；2：YS58 plasmid DNA；35: YSA plasmid DNA；6: YS352 plasmid DNA2.4目的基因在酿酒酵母中表达的蛋白检测进行转化子的SDSPAGE检测（图5），结果表明YSA表达了约60kDa的目标蛋白。2.5mleA基因在酿酒酵母中表达的功能检测对酵母转化子培养上清液进行HPLC检测，采用t检验进行L苹果酸含量及L乳酸含量与对照的差异显著性分析。重组表达质粒的转化子经过在添加了L苹果酸的培养基中培养4d，培养液上清中L苹果酸的剩余含量比对照极显著降低（表2）。对照未检出乳酸的生成，而供试转化子的乳酸生成量平均为1064mg/L，二者差异显著。L苹果酸的相对降低率平均为2095%。以上结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将培养基中的L苹果酸转化成L乳酸，使得培养液中的L苹果酸含量降低。2.6重组表达质粒的遗传稳定性问题对重组转化子的遗传稳定性进行了研究，将YSA分别在有选择压力（SD/Ura）及无选择压力（YEPD）的液体培养基中连续传代培养10d，每天取样检测质粒的丢失情况，结果表明（图6），在有选择压力条件下，质粒相对稳定，而在无选择压力条件下，传代培养10d后丢失65%左右的重组质粒。这可能是由于表达所用的载体是附加体类型所致。图5酵母转化子的SDAPAGE检测Fig.5SDAPAGE yeast transformantsM: Protein marker; 1: YS352; 2: YSA表2酵母转化子培养液中L苹果酸和L乳酸含量的检测分析Table 2Detection and analysis of Lmalate and Llactic contents in culture supernatant of yeast transformants菌株L苹果酸(mg/L)L乳酸(mg/L)苹果酸降低率（%）苹果酸相对降低率（）YS0722.34YSA25075100221.7119.16YSA34893108224.8221.73YSA45012103222.9920.18YSA54938109924.1221.36YS352 6279* 未检出*3.51-Blank6508-图6转化子YSA 质粒稳定性Fig. 6Stability of plasmids in yeast transformants2.7讨论MLF是L苹果酸在乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）的苹果酸乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）催化下直接转变成L乳酸的过程。比较表2中L乳酸的生成量和L苹果酸的降低量，其当量关系基本符合MLF途径中L苹果酸和L乳酸的当量关系。这说明L乳酸的生成，是通过MLF途径，是mleA基因在酿酒酵母中功能表达的结果。与已有的报道相比3,5,6,911，本研究使乳酸菌的苹果酸乳酸酶基因在酿酒酵母中表达的效率有所提高。这可能与采用PGKI强启动子且所构建的重组表达质粒的结构有关。尽管如此，重组酵母降解外源L苹果酸效率并不高。其主要原因是由于酿酒酵母体内缺乏L苹果酸的转运蛋白,苹果酸盐的转运效率受到限制911。如果使苹果酸通透酶与苹果酸乳酸酶协同作用，将会大大降低培养液中的L苹果酸含量。因此进行苹果酸通透酶基因与苹果酸乳酸酶基因在酿酒酵母中共转化和共表达的研究，有望进一步提高酿酒酵母重组菌株进行生物降酸的能力。而采用整合型载体，将目的基因整合到酵母的基因组DNA上，将会解决质粒遗传稳定性问题。参考文献1 李华. 现代葡萄酒工艺学. 西安：陕西人民出版社, 2000Li H. Modern Enology. Xian：Shanxi Peoples Publishing House，20002 Pascal R G, Denis D, Bernard D, et al. Handbook of Enology. London: John Wiley & Sons Ltd, 20003 Labarre C, Guzzo J, Cavin J F, et al. Cloning and characterization of the genes encoding malolactic enzyme and the malate permease of Leuconostoc oenos. Appl Environ Microbiol, 1996, 62 (4): 127412824 Dequin S. The potential of genetic engineering for improving winemakingand baking yeasts. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56:5775885 Ansanay V, Dequin S, Blondin B, et al. Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis. FEBS Lett, 1993, 332 (12):74806 Denayrolles M, Aigle M, LonvaudFunel A. Functional expression in Saccharomyce scerevisiae of the Lactococcus lactis mleS gene encoding the malolactic enzyme. FEMS Microbiol Lett, 1995, 125 (1): 37437 刘延琳，蒋思欣，李华, 等. 苹果酸乳酸发酵相关基因克隆及其在酵母中的表达. 中国生物工程杂志，2003, 23（5）：2730Liu Y L, Jiang S X, Li H, et al. China Biotechnology, 2003,23（5）：27308 刘延琳，李华, 蒋思欣, 等. 苹果酸乳酸发酵的相关酶和基因的研究进展. 微生物学通报，2003，30 (4):103107Liu Y L, Li H, Jiang S X, et al. Microbiology，2003，30(4): 1031079 Ansanay V, Dequin S, Camarasa C, et al. Malolactic fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae as compared with engineered Schizosaccharomyces pombe. Yeast, 1996, 12 (3):21522510 Bony M, Bidart F, Camarasa C, et al. Metabolic analysis of S. cerevisiae strains engineered for malolactic fermentation. FEBS Lett, 1997, 410 :45245611 Volschenk H, Viljoen M, Grobler J, et al. Engineering pathways for malate degradation in Saccharomyces cerevisiae. Nat Biotechnol, 1997, 15 (3): 25325712 Sambrook J, Fritsch E F，Maniatis T. 金冬雁, 黎孟枫译. 分子克隆实验指南.第3版. 北京：科学出版社，2002Sambrook J, Fritsch E F, Maniatia T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 3nd ed. Beijing：Science Press, 200213 Ausubel F M, Kingston R E, Seidman J G, et al. Short Protocols in Molecular Biology. Beijing：Science Press，199914 Adams A, Gottschling D E, Kaiser C A, et al. Methods in yeast genetics: a cold spring harbor laboratory course manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997. 9910215 Spencer J F T, Spencer D M, Bruce I J. Yeast Genetics, a Manual of Methods. Berlin: Springer, 1989. 45716 刘延琳，蒋思欣，何秀萍, 等. 酒类酒球菌苹果酸乳酸酶基因mleA的克隆. 农业工程学报，2004(Suppl), 20：4446Liu Y L, Jiang S X, He X P, et al. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2004(Suppl),20:444617 刘延琳，蒋思欣，李华,等. 酒酒球菌苹果酸乳酸酶基因的测序及分析.微生物学杂志，2004,24 (6)：3538Liu Y L, Jiang S X, Li H, et al. Journal of Microbiology, 2004,24 (6)：2930Cloning of Malolactic Enzyme Gene from Oenococcus oeniand Expression in Saccharomyces cerevisiaeLIU Yanlin1JIANG Sixin2HE Xiuping2LI Hua1ZHANG Borun2(1 College of Enology, Northwest A & F UniversityYangling712100, China)( 2 Institute of Microbiology，Academia SinicaBeijing100080, China)AbstractMalolactic enzyme is the function enzyme to turn Lmalic acid into Llactic acid during malolactic fermentation (MLF). mleA gene encoding for Malolactic enzyme from pLmleA, PGK1 promoter from plasmid pVC7276 and ADH1 terminator from plasmid pEA1 were ligated and inserted into YEp352, resulted the expression plasmid. Yeast transformants were screened on SD/Ura (YNB medium containing leucine, histidine and tryptophan). The target gene was detected in the yeast transformants by dot blotting hybridization. The target protein was expressed by SDSPAGE d