逆转录试剂盒( transcriptor first strand cdna synthesis kit )操作步骤.doc_第1页
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文档简介

TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit逆转录步骤1，使用前解冻结冰的试剂2，将试剂短暂离心3，冰上操作：（操作RNA实验需要戴手套）将模板与引物在PCR管上混合试剂 体积 最终浓度细胞总RNA或1ug总RNA或10ng多聚尾(A)+mRNA多聚尾(A)+mRNA任选其中一个引物:Anchored-oligo(dT)18Primer, 1ul 2.5uM50pmol/ul(vial5) 或RandomHexamerPrimer, 2ul 60uM600pmol/ul(vial6)或Sequence-SpecificPrimer 可变 0.5-2.5uM1%DEPC水,(vials7or9) 可变 使总体积为13ul总体积13ul注：以上为初次实验的推荐浓度。总RNA的适用浓度为10ug到5ng，以及mRNA的适用浓度为1到100ng,当RNA模板浓度较低时添加10ug/ml的MS2RNA*来稳定模板RNA。4，（可选）65度水浴上述混合物10分钟，使模板引物混合物变性（确保失活RNA二级结构），水浴后立即冰浴至少一分钟5，往上述混合物继续加入以下试剂（冰上操作） 试剂 体积 最终浓度.TranscriptorReverseTranscriptase 4ul 1(8mMMgCl2) ReactionBuffer,5conc.(vial2)ProtectorRNaseInhibitor, 0.5ul40U/ul(vial3)20UDeoxynucleotideMix, 2ul 每个 1mM10mMeach(vial4)TranscriptorReverse 0.5ul 10UTranscriptase,20U/ul(vial1)最终体积 20ul注：小心混合上述试剂，不要振荡，短暂离心使试剂沉在管底6，将PCR管放在PCR仪上孵育，孵育条件如下：使用的引物 目标mRNA长度 孵育温度与时间 Anchored-oligo(dT)18 不大于4kb 55度30分钟大于4kb 50度60分钟primer,50pmol/ul或 SequencespecificprimerRandomhexamerprimers, 不大于4kb 25度10分钟，然后55度 30分钟 600pmol/ul 大于4kB 25度10分钟，然后50度60分钟6,85水浴5分钟灭活逆转录酶8、20保存，或立即进行PCR。注：Randomhexamerprimer:主要用于细胞总RN
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