产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定.doc

产纤维素酶真菌的分离 筛选及酶活测定 摘 要 产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化 提高牲畜饲料利用率 堆肥的使 用以及环境污染等方面具有很高的应用价值 而分离高效纤维素降解菌是这一内容 的前提与基础 本研究利用选择培养基 CMC 培养基 从学校周围的土壤中分离得 到 6 株降解纤维素的真菌 它们都具有较强的纤维素降解能力 尤其以编号为纸绿 和江白活性最高 随后对这 6 种菌株进行酶活测定 从中得到一株高酶活的菌株 其 在 CMC 培养条件下酶活达到 40 U 关键词 纤维素降解菌 筛选 纤维素酶活 鉴定 Separation screening and enzymatic activity of cellulase produced by fungi Abstract Microbial fermentation of cellulose micro organisms especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed compost use and environmental pollution has a high application value And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard In this study selective medium CMC medium Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose They have a strong ability of cellulose degradation particularly in the number of paper green and White River the highest activity And the 6 strains with a high activity were morphological physiological and biochemical identification Key Words Cellulose degrading bacteria Filter Cellulase activity Identification 目 录 摘 要 I ABSTRACT II 1 前言 1 1 1 纤维素概述 1 1 2 纤维素酶 2 1 3 纤维素分解菌类 4 1 4 本文研究的目的与意义 6 2 实验部分 6 2 1 材料 6 2 2 主要试剂与仪器 6 2 3 培养基 8 2 4 菌种的分离与筛选 9 2 5 纤维素酶活性测定 10 2 6 形态特征观察 12 2 7 生理生化特性鉴定 12 2 8 菌种保藏 13 3 结果与讨论 13 3 1 初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 13 3 2 复筛获得的菌株图片 14 3 3 葡萄糖标准曲线的绘制 16 3 4 各菌的酶活力测定结果 17 4 结论 17 参考文献 18 致谢 20 邵阳学院毕业论文 1 1 前 言 纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源 全世界每年产农作物秸秆约 1000 2000 亿吨 我国是一个农业大国 又是一个畜牧业大国 据粗略统计 我国每 年产生农作物秸秆约 7 亿吨 含大量未降解纤维素组分的禽畜粪肥 17 3 亿吨 然而 由于纤维素中存在许多高能氢键 因此其水解 利用较困难 目前只利用了其中很 小的一部分 大部分的纤维素类物质都被弃置 既浪费资源又会对环境造成极大的 污染 因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源已成为研究开发的一个重点领 域 1 微生物在自然界纤维素的降解中有着举足轻重的作用 我国纤维素酶的研究已 有几十年的历史 并且已筛选出一批纤维素酶产生菌种 目前 用于生产纤维素酶 的微生物大多属于真菌 如木霉属 Trichoderma 曲霉属 Aspergillus 和青霉属 Penicillium 2 然而 用于纤维素酶生产的菌株普遍存在酶活力较低的问题 3 因 此 筛选优良菌种是提高纤维素酶活力 从而提高纤维素降解效率的关键 1 1 纤维素概述 纤维素是植物体中最重要的组成成分之一 是细胞壁的主要组成成分 约占植 物干重的40 以上 据粗略估计 全世界纤维素的资源约为70亿吨 而每年经绿色 植物光合作用合成的纤维素产量高达40亿吨 因此 毫无疑问 纤维素是公认的地 球上数量最丰富的可再生有机物质资源 从结构上看 纤维素是由许多个葡萄糖分 子通过 1 4 糖苷键连接而成的直链聚合物多糖 纤维素与淀粉在分子结构上的差别 仅在于葡萄糖基连接时的构型不同 淀粉是通过 1 4 糖苷键连接的 而这一不同点 使两者水解的难易程度相差悬殊 纤维素的聚合度范围非常宽 分子中单糖结构片 断可以从几百到一万五千左右 是一种高分子化合物 自然界存在的纤维素 分子链之间还存在着氢键的缔合作用 这使纤维素分子 之间形成纤维素束 天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则 松散 的无定型区组成 4 邵阳学院毕业论文 2 1 2 纤维素酶 1 2 1 纤维素酶的组成 纤维素的生物降解现象早在1886年就被发现 1912年Pringsheim首次将 纤维素 酶 cellulase 的概念引入文献中 但直到1950年之后才有纤维素酶相关的系统性文 章报道 由于纤维素物质具有复杂的结构 任何单一的酶都难以高效地水解它 因 此降解纤维素的微生物往往要产生多种纤维素酶类 还要伴随着各种半纤维素酶的 产生 组成一个复杂的酶系统以降解植物细胞壁物质 同时 又由于降解纤维素的 微生物种类不同 所产生的纤维素酶组分也不尽相同 构成了各具特色的纤维素降 解酶体系 所以 纤维素酶不是一个单种酶 而是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶 的总称 主要有C酶和G酶 是起协同作用的多组分酶系 由于微生物的不同 其产生的纤维素酶组分也是不相同的 构成了各具特色的 纤维素降解酶系 其内切酶 外切酶的含量 种类比例和活性的大小都有很大的 在同一菌株的纤维素酶系中 每一类纤维素酶往往存在多个结构 功能和活性不同 的组分 每一组分又可能由不同的亚组分组成 按照纤维素降解微生物的能力和纤 维素酶系之间的关系 可将纤维素酶系分为三类 一是对天然纤维素的降解能力比 较弱 但可大量合成分泌到胞外的纤维素降解酶系 这种酶的组分是游离的 如常 见的木霉 青霉的纤维素酶系 二是对天然纤维素降解能力强 但分泌到胞外的纤 维素酶活力较低的酶系 如担子菌类等 三是对天然纤维素分解能力强 但基本无 纤维素酶分泌到胞外的酶系 如厌氧细菌的纤维素酶系 此外 能够降解无定形纤维素和结晶纤维素的酶系称为 complete cellulase system 或全值酶系 full cellulase system 而仅能水解无定形纤维素的纤维素酶系称 为不完全酶系 uncompleted cellulase system 或低值酶系 10w value cellulase system 纤维素酶是多组分酶体系 是具有纤维素降解能力酶的总称 1950年Reese提出C G 酶的概念 随着研究的深入 每种酶的组分和作用机理已被逐渐阐明 根据它们作 用于纤维素和降解的中间产物可以分为三类 外切葡聚糖酶包括两类酶 一类是 1 4 D 葡聚糖 葡萄糖水解酶 也称为纤维素糊精酶 Ec3 2 1 74 第二类酶为纤维二 糖水解酶 cellobiohydrolases CBH 即 1 4 D 葡聚糖 纤维二糖水解酶 exo 1 4 D glucanases EC3 2 1 91 简称外切酶 CBti是纤维素酶系中的重要组分 在天然纤维 邵阳学院毕业论文 3 素的降解过程中起主导作用 可以水解微晶纤维素和棉花等结晶度高的纤维素 作 用于无定形纤维素的非还原末端或还原端 水解 1 4 D 糖苷键 依次切下一个纤维 二糖分子 生成可溶的纤维糊精和纤维二糖 内切纤维素酶 endoglueanases EG 或 内切葡聚糖酶 即内切 1 4 D 葡聚糖q 葡聚糖水解酶 endo 8 glucanasea EC3 2 1 4 简称内切酶 也称cx酶 CMC酶 内切纤维素酶随即地水解磷酸膨胀纤维素 羧甲 基纤维素等无定形纤维素的非定形区 无规则水解 1 4 D 糖苷键 形成葡萄糖 纤 维二糖纤维三糖和不同大小的纤维糊精 为纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的 末端 1 4 D 葡萄糖苷酶 6 glucosidases B 6或BG 或B D 葡萄糖苷 葡萄糖水解酶 EC3 2 1 21 又称纤维二糖酶 cellobiase CB 它主要裂解纤维二糖和从小的纤维 素糊精的非还原末端水解葡萄糖残基 生成葡萄糖产物 它的水解速率随底物大小 的降低而增加 以底物为纤维二糖时水解速率最快 严格地讲 葡萄糖苷酶不能算 作纤维素酶 但它可以减轻纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用 酶解纤维素时 对无定形区仅EG即可使之水解 对于结晶区需要有EG和CB的协同作用 因此 在 纤维素溶解糖化过程中与CBH的比值会显著地影响纤维素溶解活力 而且在纤维素 糖化过程中CB组分的加入会使这种协同作用大大加强 但是 CB与EG CB与CBH 的协同作用都很弱 1 2 2 纤维素酶的种类以及作用机理 微生物分解纤维素依赖于细胞所产生的纤维素酶 纤维素酶不是单种酶 而是 起协同作用的多种酶系 14 可分为以下三类 第一类是葡聚糖内切酶 或称CMC酶 或CX酶 这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区 随机水解 1 4 糖苷键 将长 链纤维素分子截短 产生大量带非还原性末端的小分子纤维素 第二类是葡聚糖外 切酶 或称微晶纤维素酶 纤维二水解酶或C1酶 这类酶作用于纤维素分子末端 水解 1 4糖苷键 每次切下一个纤维二糖分子 第三类是 葡萄糖苷酶 1 4 glucanase EC 3 2 1 2l简称BG 或称纤维素二糖酶 这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖 分子 虽然它对纤维素无作用 但它可以消除上述两种酶催化反应的终产物对反应 的抑制作用 从而加快反应速度 纤维素酶的降解机理 1950年 Reese等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产 出分解棉花中的天然纤维素的酶 但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或 邵阳学院毕业论文 4 纤维素诱导体等非晶体性纤维素 因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不 同的酶协同作用才能分解的C1 Cx假说 该假说认为 当纤维素酶作用时 首先对 纤维素的Cl组分起作用 继而使Cx组分变成纤维低聚糖 再由 葡萄糖苷酶分解成 葡萄糖 Wood在研究木霉 Trichodermareesei 青霉 Penicilli umfuniculosumde 的纤 维素酶水解纤维素时 发现培养液中的两种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具 有协同作用 Kanda等还发现只是对可溶性纤维素进攻方式不同的两种内切葡萄糖酶 在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作用 协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首 先进攻纤维素的非结晶区 形成外切纤维素酶需要的新的游离末端 然后外切纤维 素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位 葡萄糖苷酶再对纤维二糖单位进行 水解 形成葡萄糖 目前人们普遍认为纤维素酶是分解以 1 4葡萄糖苷键结合的纤 维素物质 首先由Cx组分对纤维素的非晶体部分进行切割 然后由Cl组分以纤维二 糖为单位从末端对其缓缓分解 最终由 葡萄糖苷酶分解为葡萄糖 1 3 纤维素分解菌类 1 3 1 纤维素分解菌类简介 自然界能产生分解纤维素的酶的微生物很多 包括细菌 放线菌和真菌 5 自 1906年Selliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶以来 人们相继在细菌 真菌等微生 物中分离到能降解纤维素的酶 其中 以细菌的生长和降解效果较稳定 但对纤维 素作用较强的是木霉属 Trichoderma 曲霉属 Aspergillus 青霉属 Penieillium 和枝 顶孢霉属 Aeremonium 的菌株 其中真菌木霉属是迄今所知形成和分泌纤维素酶系 成分最全面 获利最高的一个属 国内外许多研究人员对此作了很多报道 经形态 学 生理生化反应 生态特性和遗传型的鉴定 WQ 1归类为瘤胃球菌属 Rum inococcus 的黄色瘤胃球菌 Rum inococcus flavefaciens WH 2归类为丁酸弧菌属 utyrivibrio 的溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibriofibrisolvens 2002年 崔宗均等从4种堆肥样品中分别筛选出纤维素分解能力较强的4组混合 菌 再以酸碱反应互补的原则重新优化组合并驯化成组纤维素分解能力非常强而稳 定的纤维素分解菌复合系MCl 同年 魏桃员等从造纸厂污泥中分离得到了一株能 以纤维素为唯一碳源生长良好的纤维素降解菌w23 经鉴定 为假单胞杆菌 2005 年 Souichiro Kato等构建了由五种细菌 梭菌属菌株CSKl 梭菌属菌株FG4 黄原酸 邵阳学院毕业论文 5 假单胞菌属菌株M1 3 短芽孢菌属菌株M1和博尔德氏杆菌属菌株M1 组成的可降解 纤维素的群落 命名为SF356 该群落经20次继代培养它们仍能稳定共存 并且降解 纤维素的能力增强了 2006年 吴敏峰等采集健康奶牛的新鲜粪便 利用刚果红平板染色法分离筛选 具有产纤维素酶活性的芽孢杆菌 并进行细菌菌落 形态和生化鉴定 结果从牛粪 中分离出35株兼性厌氧的芽孢杆菌 利用刚果红鉴别培养基筛选出具有分解纤维素 能力的菌株 并测定其水解圈大小 初步筛选出10株纤维素酶高产菌株 并对其进 行了种属鉴定 一株为梭状芽孢杆菌 其余9株为芽孢杆菌属细菌 2006年 伍时华等通过羧甲基纤维素琼脂平板 滤纸条培养基从自然环境中筛 选到4株高效纤维素降解菌 其中木霉2株 青霉2株 分别记为T 1 T 2 P 1和P 2 2006年 朱军莉等从袋装降解的笋干中分离到一株分解纤维素的细菌菌株 该菌 株呈长杆状 革兰氏染色为阳性 产芽孢 命名为BSX5 经鉴定 确定该菌株为枯 草芽孢杆菌 2007年 刘玉承等从日粮精粗比为3 7的小尾寒羊 蒙古羊杂交一代绵羊的瘤胃 内容物中分离到2株严格厌氧细菌 一株球菌WQ 1 l株弧菌WH 2 二者对滤纸有很 好的降解能力 通过酶活力试验测得WQ 1的滤纸酶活 羧甲基纤维素酶活和p2葡萄 糖苷酶活分别为0 66 U mL 7 0 U mL和15 3 U mL WH 2的滤纸酶活 羧甲基纤维 素酶活和D 葡萄糖酶活分别为0 52U mL 6 9 U ml和17 2 U mL 同年 韩绍印等从造纸厂废纸浆中分离到一株纤维素降解细菌CP4 在温度为 20 50 和pH为5 10的条件下 CP4能够快速生长并分泌纤维素酶 在35 和pH为 9的条件下 培养8 h后CP4开始产酶 培养3 d后相对酶活为5 43 mm d 经初步鉴定 确定该菌株为巨大芽孢杆菌 Bacillus magaterium 1 3 2 纤维素分解菌的选育 近年来 在纤维素分解菌研究领域 还有人通过对已发现纤维素分解菌进行诱 变 来增加产酶微生物菌种资源 提高纤维素酶的产量 并取得了较大的进步 9 木霉菌经化学 物理诱变后 其变异株产纤维素酶性能明显提高 Hideo等 10 将0 10 秋 水仙素处理35 d的里氏木霉 Trichoderma reese RUTC230 用灭菌灵单倍体化 从单 倍体克隆长成的分生孢子器中分离出高产纤维素酶菌株 随后分别用含有1 废纸粉 邵阳学院毕业论文 6 的培养基作为选择培养基和含有1 的微晶纤维素的培养基作为二级选择培养基进行 筛选 筛选出的WP 1菌株对羧甲基纤维素钠 CMC 微晶纤维素和水杨苷活力分别 是原始菌株的1 9 2 0和3 5倍 韩峰等 11 以拟康氏木霉 Trichoderma pseudokoningii TH为出发菌株 采用紫外诱变获得一株抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UVIII 纤维素 酶产量显著提高 Prabavathy等 12 将里氏木霉制备成原生质体并融合 在CMC琼脂 平板上再生 筛选了15个融合体 相对于原始菌株 在CMC平板上出现的透明圈更 加明显 其中 有2株融合子SFTr2和SFTr3相对于原始菌株PTr2酶活提高了2倍多 13 纤维分解细菌经离子束注入诱变 其突变菌株产纤维素酶活性也明显提高 曾宪贤 2005 等对纤维分解细菌HY2进行不同剂量离子束注入诱变 筛选出纤维素酶活性高 的突变菌株HY2 3 通过聚合酶链式反应PCR技术扩增得到纤维素酶高产菌株芽孢杆 菌 Bacillus sp HY2 3以及原始菌株芽孢杆菌HY2的纤维酶基因chy2 3和chy2 经过克 隆和序列分析表明 所得到的突变型和野生型纤维素酶基因编码区均为1500 bp 同 时发现 经过离子束诱变得到的高产菌株和野生菌株的纤维素酶基因序列存在差别 这些碱基突变引起氨基酸序列的改变有可能导致两个菌株纤维素酶产量上的不同 1 4 本文研究的目的与意义 本文主要从邵阳学院周围的土壤筛选出能够高效降解纤维素的菌株 并从形态 学和生理生化等方面对筛得的菌株进行菌种鉴定 高效纤维素降解菌在环境污染 堆肥 动物饲料等方面起到不可替代的作用 2 实验部分 2 1 材料 微生物分离样品来自邵阳学院周边的土壤 2 2 主要试剂与仪器 2 2 1 主要药品及试剂 本实验所用的主要试剂见表2 1 表 2 1 试剂 Table2 1 regents 药品名称分子式纯度或含量生产厂家 邵阳学院毕业论文 7 磷酸氢二钾K2HPO4 3H2OAR天津市东丽区泰兰德化学试剂厂 磷酸二氢钾KH2P04AR天津市东丽区泰兰德化学试剂厂 硝酸钠NaNO3AR天津市科密欧化学试剂有限公司 硫酸镁MgSO4AR上海试一化学试剂有限公司 氯化钙CaCl2AR天津市天达净化材料精密化工厂 氯化钠NaClAR天津市凯通化学试剂有限公司 氯化钾KCl H2OAR天津市科密欧化学试剂有限公司 硫酸亚铁FeSO4 7H2OAR天津市恒兴化学试剂制造有限公司 硫酸锌ZnSO4 7H2OAR天津市化学试剂三厂 硫酸锰MnSO4 H2OAR上海实验试剂有限公司 羧甲基纤维素钠C6H11NaO7AR上海山浦化工有限公司 柠檬酸钠C6H5Na3O7 2H2OAR天津市天力化学试剂有限公司 刚果红C32H22N6Na2O6S2AR湖南湘大化工试剂有限公司 柠檬酸C6H8O7 H2OAR上海国药集团化学试剂有限公司 3 5 二硝基水杨酸C6H8O7 H2OAR国药集团化学试剂有限公司 琼脂AR武汉鼎国生物技术有限公司 注 1 AR Analytical reagent 分析纯试剂 2 主要分子生物学试剂见具体实验方法部分 1 DNS试剂 称取5 g 3 5 二硝基水杨酸溶于蒸馏水中 加入10 g氢氧化钠 100 g酒石酸钾钠和250 mL水 加热溶解后再加入结晶酚1 g 无水亚硫酸钠0 5 g 待全部溶解后冷却 定容至500 mL 贮于棕色瓶中 放置一周后使用 使用前过滤 2 l 刚果红试剂 称取刚果红试剂l g于干净的小烧杯中 用量筒量取蒸馏水 100 mL使之溶解 过滤 贮于棕色试剂瓶中 3 0 2 M Na2HPO4溶液 取17 907 g Na2HPO4 12H2O加水溶解 定容至250 mL 4 0 1 M柠檬酸 取5 2535 g柠檬酸加水溶解 定容至250 mL pH 7 0 5 pH 4 4 Na2HPO4 柠檬酸缓冲液 量取205 875 mL 0 2M Na2HPO4和44 125 mL 0 1 M柠檬酸于250 mL烧杯中 调pH值 贮于试剂瓶中备用 6 1 CMC溶液 取l g CMC粉末缓慢的加到l00 mL pH4 4的Na2HPO4 柠檬酸缓 冲液中 边加边搅拌 并用热水浴使其充分溶解 转于试剂瓶并放冰箱保存 2 2 2 实验仪器 高压蒸汽灭菌锅 细菌培养箱 离心机 分光光度计 震荡培养箱 水浴锅 普通光学显微镜 数字显微图像处理系统 激光共聚焦显微镜 PCR仪 电泳仪 冰箱 超净工作台 电热炉 紫外诱变箱 微波炉 PH计 电子天平等 邵阳学院毕业论文 8 2 3 培养基 1 羧甲基纤维素钠培养基I CMC Na 20 g NaCl 5 0 g MgSO4 7H2O 0 2 g KH2PO4 1 0 g 酵母浸出物5 0 g 蛋白胨10 g 水1000 mL 琼脂20 g pH自然 121 灭菌20 min 2 羧甲基纤维素钠培养基II CMC 20 g Na2HPO4 2 5 g KH2PO4 0 5 g 白胨 2 5 g 酵母膏0 5 g 水1000 mL 琼脂20 g pH自然 121 灭菌20 min 3 发酵培养基 CMC 20 g Na2HPO4 2 5 g KH2PO4 1 5 g 蛋白胨2 5 g 酵母 膏0 5 g 水1000 mL pH自然 121 灭菌20 min 4 滤纸条培养基 试管中加入上述无机盐溶液5 mL 加1条瓦特曼滤纸 6cm 1cm 垂直立于试管中 并使一部分露出液面 加棉塞121 30 min灭菌 5 刚果红纤维素琼脂培养基 KH2PO4 0 5 g MgSO4 7H2O 0 25 g 琼脂15 g 明胶2 0 g CMC1 88 g 刚果红0 20 g 蒸馏水1000 mL pH值自然 6 PDA培养基 马铃薯200 g 葡萄糖20 g 琼脂20 g 水1000 mL 自然PH 制法 马铃薯去皮后 切成小块 加水煮烂 煮沸20 30 min 能被玻璃棒戳破即可 用4层纱布过滤 再加糖和琼脂 加热融化后飞 再补足水分至1000 mL 121 下灭菌20 min 7 察氏培养基 硝酸钠3 g 磷酸氢二钾1 g 硫酸镁 MgSO4 7H2O 0 5 g 氯 化钾0 5 g 硫酸亚铁0 01 g 蔗糖30 g 琼脂20 g 蒸馏水1000 mL 8 改良马丁培养基 蛋白胨5 0 g 磷酸氢二钾1 0 g 酵母浸出粉2 0 g 硫酸 镁0 5 g 葡萄糖20 0 g 水1000 mL 9 基础培养基 NH4 2SO4 2 g MgSO4 7H2O 0 2 g NaH2PO4 H2O 0 5 g CaCl2 2H2O 0 1 g K2HPO4 0 5 g 蒸馏水1000 mL pH 6 5 10 淀粉水解琼脂培养基 可溶性淀粉 20 0 g MgSO4 7H2O 0 1 g K2HPO4 0 5 g NaCl 0 5 g KNO3 1 0 g 琼脂 20 g 蒸馏水1000 mL pH 7 2 7 4 121 灭 菌20 min 11 纤维素水解培养基 MgSO4 0 5 g K2HPO4 0 5 g NaCl 0 5 g KNO3 1 0 g 蒸馏水1000 mL pH 7 2 滤纸条 6 cm 1 cm 分装于试管中 将滤纸条加入试 管中 一半浸在液内 一半露在液面外 121 灭菌20 min 邵阳学院毕业论文 9 12 保藏用真菌PDA培养基 g L 200 g马铃薯加水1000 mL煮费后 再小火煮 30 rnin 8层纱布过滤 加蔗糖20 g 补水1000 mL pH 6 5 2 4 菌种的分离与筛选 2 4 1 分离与初筛菌株的方法 1 配CMC培养基 灭菌 倒平板 2 制备土壤稀释液 称取土样10 g 放入盛90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶中 振摇约20分钟 使土样与水充分混合 将菌分散 3 划线 用接种针蘸取适量稀释液在平板上划线 每个平板划3到5条线 4 培养将培养基平板倒置于28 温室中培养3日 5 挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上 置28 29 温室中培养 待菌苔长出后 观察水解圈情况 将菌落用l mg L果红染 色5 min 将颜色变红的菌落继续划线分离 检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染 色检查是否是单一的微生物 若有其他杂菌混杂 就要再一次进行分离 纯化 直 到获得纯培养物 6 观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况及菌落形态 等 2 4 2 菌株的复筛 1 配CMC培养基 灭菌 倒平板 2 划线 用接种针挑取适量初筛的菌种在平板上划线 每个平板划3到5条线 3 再次挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到羧甲基培养基的平面上 置28 29 温室中培养 待菌苔长出后 观察水解圈情况 将菌落用l mg L果红染 色5 min 将颜色变红的菌落继续划线分离 检查菌苔是否单纯也可用显微镜涂片染 色检查是否是单一的微生物 若有其他杂菌混杂 就要再一次进行分离 纯化 直 到获得纯培养物 4 观察将纯化得到的纤维素降解菌进行观察对比并记录生长情况 邵阳学院毕业论文 10 2 5 纤维素酶活性测定 2 5 1 绘制葡萄糖标准曲线 原理 3 5 二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物 在一定 范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系 利用分光光度计测出其在540 nm处 的吸光度 得出还原糖的量 配制方法 将葡萄糖放在80 烘干箱内烘干至恒重 然后精确称取0 040 g葡萄 糖固体溶解于少量蒸馏水中 然后用蒸馏水定容至20 mL 充分混匀 得浓度为2 mg mL的葡萄糖标准溶液 标准曲线的绘制 用1000 mL移液枪分别量取0 L 200 L 400 L 600 L 800 L 1000 L 1200 L于7个干净的20 ml刻度试管中 用蒸馏水定容 得 到浓度分别为 0 g mL 20 g mL 40 g mL 60 g mL 80 g mL l00 g mL 120 g mL的葡萄糖溶液 各取4 mL加入到已作好标记的带有刻度的试管中 再分别加入DNS试剂2 mL 加热煮沸5 min 取出置冷水中冷却 定容至6 mL 在分 光光度计上测量吸光值 波长为540 nm 以浓度为0 g mL的葡萄糖反应液体作空白 对照 2 5 2 粗酶液的制备 在250 mL三角瓶中装50 mL培养基 将各菌株接种 30 旋转摇床振荡培养 24 h作种子液 用1000 L移液枪量取500 L转接于250 mL三角瓶中的50 mL培养基 中 于30 振荡培养48 h 在4 8000 r min离心20 min除去菌体 取上清液作为4 保存待用 2 5 3 酶活力测定方法 关于纤维素酶活力的测定方法很多 至今也没有统一定论 而且用不同方法测 定 结果也存在一定差异 Teather等认为 对数酶浓度同刚果红染色水解圈存在线 性关系 产酶越多 透明圈越大 产酶越快 透明圈出现越早 然而 虽然透明圈 大小直接反映了酶浓度的高低 但不能完全代表菌株产酶能力 试验表明 液体样 品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系 可以对酶活进行初步定量 但不能作为菌 株产酶活力大小的唯一定量指标 因为刚果红纤维素平板筛选法受菌苔大小 菌苔 邵阳学院毕业论文 11 在平板上的堆积情况 菌落之间相互位置和产物或分泌物的相互抑制 不同菌株生 长和产酶速度 不同细菌细胞壁的特性等因素的影响 并不能精确反应纤维素酶活 力的大小 15 因此本试验最初以水解圈的大小来判定纤维素降解能力 进而筛选出 纤维素降解能力较强的菌株 酶活力测定中大都采用DNS法来测定还原糖的生成量 因为该法简易 灵敏度 较高 但是由于纤维材料水解的是包括葡萄糖 纤维二糖及几种纤维寡糖的混合物 因此以葡萄糖为标准反映出的还原糖生成量与实际还原糖的生成量有一定的差异 这种差异很小 一般的定糖方法无法解决 只有用高效液相色谱 HPLC 等分析方法 才能实现 16 由于实验条件和时间的限制 本试验以葡萄糖为标准测定还原糖含量 不考虑不同还原糖的差异 因此本试验采用DNS法来测定纤维素酶活力的大小 具 体操作方法如下 以2 mL 1 0 CMC溶液为底物 用pH为4 4 浓度为0 2 mo1 L Na2HP04 0 1 mol L 柠檬酸缓冲液配制 加200 L上清液 再加2800 L蒸馏水 于50 保温30 min 然 后加人2 mL DNS试剂 沸水浴5 min 然后一起放入凉水至室温 在540 nm测光密 度值 OD540nm 以相应空白样 2 mL 1 0 CMC溶液为底物 3 mL灭菌的发酵培养液 于47 保温30 min 然后加入2 mL DNS试剂 沸水浴5 min 然后一起放入凉水至室 温 2 5 4 酶活力计算方法 葡萄糖浓度计算公式 根据葡萄糖标准曲线 将吸光度值代入一元线形回归方 程 即可得到葡萄糖的浓度 x y b k ug mL x代表横坐标葡萄糖的生成量 葡 萄糖浓度换算公式 见公式 2 1 x2 4x1 3 2 1 y代表纵坐标 b代表截距 k代表斜率 xl代表利用葡萄糖标准曲线获得的相应 葡萄糖浓度 x2代表酶液作用一定量底物后生成的葡萄糖的浓度 根据酶活力定义得 酶活力计算公式 2 2 U x t u 2 2 U代表酶活 t代表酶作用时间 u代表稀释度 酶活力单位定义为 在测定条件下 分解l CMC溶液每分钟产生l g葡萄糖定 邵阳学院毕业论文 12 义为1个纤维素酶活力单位 筛选出产纤维素酶活力较高的菌株作进一步的鉴定和产酶条件的研究 2 6 形态特征观察 2 6 1 菌落形态观察 纯化了的菌株分别划线和点种于平板上 30 培养 观察菌落形态 显微镜水浸片观察法 取干净载玻片 加无菌水一滴 用接种环挑取少量菌体 放入无菌水中 盖好盖玻片 镜检 2 6 2 培养特征观察 将菌株分别接种在CMC培养基平板上 于30 培养 分别于7 d 15 d和30 d肉 眼观察其培养特征及颜色变化 取成熟期的颜色作为定种的依据 观察和记录如下 项目 气生菌丝体颜色 指孢子丝未形成前的颜色 孢子丝和孢子的颜色 即成熟孢子堆的颜色 基质菌丝体的颜色 即菌落背面的颜色 另外 还要观察记录菌株在以上各种培养基上生长的情况 菌落的外观形态如 粉状 绒状和棉絮状等作为参考特征 17 2 7 生理生化特性鉴定 2 7 1 淀粉水解 许多细菌产生淀粉酶 能水解培养基中的淀粉为无色糊精等小分子物质 或进 一步水解为麦芽糖或葡萄糖 淀粉水解后 遇碘不变蓝色 具体方法如下 1 将刚灭菌的已溶化的淀粉培养基冷却至50 左右 无菌操作制成6个平板 2 将待鉴定的菌株在不同的板上划线接种 每种菌接两个平板 剩余两个作 为空白对照 3 将接种了待鉴定菌株的平板和空白对照平板倒置在30 培养箱中培养 4 观察各种细菌的生长情况 培养3 4 d 多数菌株已生长成熟 将平板打开 盖子 滴入少量LUGOL S碘液于平皿中 轻轻旋转平板 使碘液均匀铺满整个平板 邵阳学院毕业论文 13 5 如菌苔周围出现无色透明圈 说明淀粉已被水解 为阳性 透明圈的大小可 初步判断该菌水解淀粉能力的强弱 即产生胞外淀粉酶活力的高低 2 7 2 纤维素水解试验 1 将刚灭菌的纤维素水解培养基放置于无菌操作台冷却 2 将待鉴定的菌株接种在液面外一段滤纸条上 另留两管作为空白对照 3 将接种了待鉴定菌株的试管和空白对照试管放置于试管架中 置于30 的培 养箱中培养 4 第5 d观察结果 如菌种能在滤纸条上生长 并分解纸条成一团松散纤维 或使之折断 碎裂成粉质状 表示该菌株产生纤维素酶 若纸条不被分解 则该菌 株不产生纤维素酶 2 8 菌种保藏 纸绿 江白 江长毛 江短毛 江土利用PDA培养基保藏于 80 冰箱中 瘤黑 利用改良的马丁培养基保藏与 80 冰箱中 3 结果与讨论 3 1 初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 初筛后得到的各菌株的菌落形态特征如表3 1 表 3 1 初筛后各菌株的菌落形态 Tab3 1 Colony morphology of the various strains after the initial screening 菌株名称菌落颜色菌落边缘表面特征水解圈描述 纸绿先期黄色 后期绿色不整齐 齿状表面光滑明显 江白白色不整齐 齿状表面光滑明显 江长毛乳白色 背面黄色不整齐 齿状表面光滑明显 江短毛乳白色 背面红色不整齐 齿状表面光滑明显 瘤黑黑色不整齐 齿状表面光滑明显 江土 正面带黄色的白色 背面显红色 不整齐 齿状表面光滑明显 邵阳学院毕业论文 14 3 2 复筛获得的菌株图片 1 纸绿 在PDA琼脂培养基上28 培养 菌落初为白色絮状 继而转为浅 绿色 后变为深绿色 菌落背面无色略灰色 如图3 1 图3 1 纸绿在PDA培养基上生长情况 Fig 3 1 The growth of Zhilv on the PDA medium 2 江土 在PDA琼脂培养基上28 培养 菌落为带黄色的白色 背面显血红 色 如图3 2 3 3所示 图3 2 江土在PDA培养基上 正面 生长情况 Fig 3 2 The growth of Jiangtu on the PDA medium positive 图3 3 江土在PDA培养基上 反面 生长情 况 Fig 3 3 The growth of Jiangtu on the PDA medium negative 3 瘤黑 在PDA琼脂培养基上28 培养 菌落显黑色 孢子黑色 后期孢子 很多 很干燥 生长旺盛 菌丛黑褐色 顶囊大球形 小梗双层 分生孢子为球形 呈黑色 粗糙且干燥 菌丝发达多分枝 上分生孢子头状如 菊花 如图3 4所示 邵阳学院毕业论文 15 图3 4 瘤黑在PDA培养基上生长情况 Fig 3 3 The growth of Liuhei on the PDA medium 4 江长毛 在PDA琼脂培养基上28 培养 乳白色 棉絮状 在CMC培养基 上毛长的非常长 覆盖整个培养皿 菌丝很明显 背面黄色 在PDA上生长一般 如图3 5 3 6所示 图3 10 长毛在PDA培养基上 反面 生长情况 图3 5 长毛在PDA培养基上 正面 生长情况 Fig 3 5 The growth of Changmao on the PDA medium positive 图3 6 长毛在PDA培养基上 反面 生长情况 Fig 3 5 The growth of Changmao on the PDA medium negative 5 江短毛 在PDA琼脂培养基上28 培养 菌落显白色 菌丝较短 光滑 背面显红色 如图3 7 3 8所示 邵阳学院毕业论文 16 图3 7 短毛霉在PDA培养基上 反面 生长情况 Fig 3 7 The growth of Duanmaomei on the PDA medium negative 图3 8 短毛霉在PDA培养基上 正面 生长情况 Fig 3 8 The growth of Duanmaomei on the PDA medium positive 3 3 葡萄糖标准曲线的绘制 通过配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液 利用DNS法分别对它们在540nm下进行 了吸光度测量 绘制的标准曲线见图3 9 图3 9 葡萄糖标准曲线 Fig 3 9 The standard curve of glucose 其中葡萄糖量由公式y 5 43x 0 0906推出x y 5 43 x即为葡萄糖量 单位mg mL 邵阳学院毕业论文 17 3 4 各菌的酶活力测定结果 各种菌株的CMC酶活测定结果如表3 2 表3 2 菌株的CMC酶活 CMC培养基 测定结果 Tab 3 2 Strains of CMC activity CMC medium determination results 菌株纸绿江白江土江长毛江短毛瘤黑 吸光度4 0873 132 810 7021 620 420 酶活 U 5038 4334 58 6219 895 16 吸光度5 473 392 510 7122 020 381 酶活 U 67 1542 6230 88 7424 84 68 各菌的酶活性和各个菌株的产酶能力有一定的差异 说明各个菌株间的产酶能 力有显著性