食品安全现代生物检测技术.ppt

第六章食品安全现代生物检测技术第一节免疫学检测技术第二节PCR检测技术第三节转基因食品的检测技术 第一节免疫学检测技术一 概述抗原与抗体的结合反应是一切免疫测定技术的最基本原理 在此基础上结合一些生化或理化方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定法 如放射免疫测定法 酶免疫测定法 荧光免疫测定法等 一个成功的免疫测定法必须具备3个要素 性能优良的抗体 灵敏和专一性的标记物和高效的分离手段 按照是否使用标记物分为标记免疫测定法和非标记免疫测定法 后者又称为经典免疫测定法 按反应介质分为均相或非均相 免疫复合物需分离后检测 免疫测定法 按反应状态分为平衡态或非平衡态免疫测定法 按照标记物种类 标记免疫测定法又分为放射性标记测定法和非放射性标记测定法 目前最常用的免疫学检测技术如下 1 放射免疫测定技术 2 酶免疫测定技术 3 荧光免疫测定技术 4 发光免疫测定技术 5 胶体金免疫测定技术 二 酶联免疫吸附试验 ELISA 一 ELISA的基本原理ELISA Enzyme Linkedimmunosorbentassay 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记 这一方法的基本原理如下 1 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 井保持其免疫活性 2 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 二 ELISA的类型ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型 1双抗体夹心法测抗原2双抗原夹心法测抗体3间接法测抗体4竞争法测抗体5竞争法测抗原 三 ELISA的材料与试剂完整的ELISA试剂盒包含以下各组分 已包被抗原或抗体的固相载体 免疫吸附剂 酶标记的抗原或抗体 结合物 酶的底物 阴性对照品和阳性对照品 定性测定中 参考标准品和控制血清 定量测定中 结合物及标本的稀释液 洗涤液 酶反应终止液 1免疫吸附剂2结合物3酶的底物4洗涤液5酶反应终止液6阳性对照品和阴性对照品7参考标准品 三 磺胺二甲嘧啶的间接竞争ELISA检测 一 人工完全抗原的合成 二 合成抗原的鉴定 三 抗体的制备与纯化 四 标准竞争抑制曲线的制作 五 畜产品中SM2残留的ELISA检测 六 方法评价1特异性2灵敏度3准确度4精确度 第二节PCR检测技术一 概述PCR又称聚合酶链式反应 Polymerasechainreaction 是1985年由美国的KaryMullis首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法 应用该方法可使极微量的特定DNA片段在几小时内迅速扩增至百万倍 因而一经问世便在短短的数年内就得到了迅速发晨和实际应用 并在原有基础上结合各种生化分子生物学技术衍生出了许多改良技术 这些技术显示出了巨大的潜力 发挥着越来越大的作用 也正因为如此它们被誉为20世纪80年代分子生物学革命和生物技术的飞跃 一 PCR原理PCR是依据DNA模板的特性 模仿体内的复制过程 在体外合适的条件下以单链DNA为模板 以人工设计和合成的寡核苷酸为引物 利用热稳定的DNA聚合酶延5 3 方向掺人单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术 二 PCR反应体系PCR反应体系主要由引物 dNTP DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 缓冲液 Mg2 和核酸模板组成 三 PCR反应参数在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长 以免降低TaqDNA聚合酶的活性 下面介绍PCR反应中的一些具体参数 1 变性2 退火3 延伸4 循环次数 四 常见的PCR种类1 热启动PCR2 一步单管PCR3 多重PCR4 依赖PCR的DNA指纹图谱技术5 PCR 单链构想多态性分析6 mRNA差异显示技术7 随机引物扩增DNA多态性 RAPD 8 以微卫星DNA介导的PCR技术9 基因间重复性回文片段 REP 和基因内重复性一致序列 ERIC 的扩增10 扩增片段长度多态性分析 AFLP 11 限制性长度多态性分析 RFLP 12 用于RNA病毒检测的核酸扩增技术 五 PCR技术用于检测的主要步骤 1 运用化学手段对目标DNA进行提取 2 设计并合成引物 引物设计或合成的好坏直接决定PCR扩增的成效 3 进行PCR扩增 4 克隆并筛选鉴定PCR产物 将扩增产物进行电泳 染色 在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带 根据该带的不同即可鉴定不同的DNA 5 DNA序列分析 第三节转基因食品的检测技术一 概述转基因食品又称遗传修饰食品 geneticallymodifiedfood 简称GMF或GM食品 转基因食品大体上分为如下三类 1 转基因植物食品由转基因植物如转基因的玉米 大豆 水稻 马铃薯 番茄 香蕉 苹果 菠菜等生产加工而成 2 转基因动物食品如转基因的鱼 鸡 牛 羊等 目的主要通过导入外源基因或对自身基因加以修饰来使受体动物降低结缔组织交联度 改善肉质 或使受体生物个体肥大 或生产营养价值高的蛋 肉 乳等 3 转基因微生物食品如转基因微生物发酵而制得的葡萄酒 啤酒 酱油等 此类食品是利用转基因微生物 如转基因酵母和酶 的作用而生产出来的食品 后两类转基因食品目前在市场上还很少 一 ELISA技术与转基因食品检测l ELISA基本原理建立在抗体抗原免疫学反应的基础上 ELISA分析法必须具备待检测的固定相抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物三种试剂 且满足两个前提条件 待检测的抗原或抗体能够结合到不溶性载体表面并保持活性 标记酶能与抗原或抗体结合并同样保持各自生物活性 ELISA分析基本步骤如下 将抗原 Ag 或抗体Ab结合到固相载体平板的孔里 待测溶液的特殊抗原或抗体结合到敏化载体表面 加入酶标抗体使之与抗原或抗体化合物相结合 结合物通过标记酶催化底物的颜色改变而被检测 通过最后溶液的颜色深浅对待侧抗原或抗体进行定量分析 2 ELISA分析法的灵敏度3 ELISA分析法的要点特异性高 获得结果快 仪器简单 易于操作 对人员要求不高 免却了对样品进行核酸提取的麻烦 同时可降低检测的成本 由于酶既有很高的催化效率 可极大的放大反应效果 从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性 二 PCR技术与转基因食品的检测1 PCR技术对转基因食品的定性检测 1 PCR基本原理PCR技术由美国Centus公司KaryMullis发明 20世纪90年代逐渐成熟应用 简单地说PcR就是利用核酸DNA聚合酶 引物和4种脱氧单核苷酸在试管内完成模板DNA的快速复制 2 PCR技术检测转基因食品的技术关键和理论依据 3 PCR检测转基因食品的基本步骤 待检材料DNA提取 通常利用CTAB法从食品材料中提取核酸 PCR反应 设计合适引物 PCR扩增待检样品中的靶标DNA 观测PCR产物 通过凝胶电泳分析将PCR产物展现 确定结果 有时为了避免假阻性 还需要对PCR产物进行限制性酶切分析进行质量控制 2 PCR技术对转基因食品的定量检测目前基于GMO特异DNA片段的定性PCR筛选方法已广泛应用于GMO食品检测 但是随着各国有关GMO标签法的建立和不断完善 对食品中的GMO含量的下限已有所规定 为此 研究者在定性筛选PCR方法的基础上发展了不同的定量GMO的PCR检测方法 目前 国外较为成熟的方法主要有半定量PCR法 定量竞争PCR QuantitativecompetitivePCR 和Real timePCR 实时定量PCR 法等三种 1 半定量PCR法 样品DNA的提取和定量 按常规方法提取DNA后 取部分样品DNA在0 8 琼脂糖凝胶中电泳 与已知古量的Marker比较 用计算机凝腔成像分析系统处理结果 以确定所提取的DNA量 例如 一般700mg的玉米粉可提取l gDNA PCR反应 a 样品DNA的质量分析b 建立内部参照反应体系c 测定CaMV35S启动子的定量PCR反应 2 定量竞争PCR法PCR反应实质是对特定模板DNA的指数扩增放大 而在相同的条件下 获得DNA的量与最初模板DNA的浓度成正相关 竞争定量PCR就是依据这种扩增DNA与模板DNA之间的浓度相关性设计的 基本原理是先构建含有修饰过的内部标准DNA片段 竞争DNA 竞争DNA由质粒组成 带有一个改造PCR扩增子 改造部分可以是DNA插人序列 缺失序列或者点突变 竞争DNA与待测目标DNA在同一反应管中进行PCR共扩增 因竞争DNA片段和待测DNA的大小不同 经琼脂糖凝胶可将两者分开 通过比较两种条带的量可进行定量分析 三 生物芯片与转基因产品检测就目前转基因食品检测中常用的ELISA和PCR技术而言 最大的缺点是检测范围窄 效率低 无法高通量大规模地同时检测多种样品 尤其是对转基因背景一无所知的情况下 对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的 而目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种 今后都有可能进入商品化生产 显而易见对进出口产品的检测 需要有更有效的 快速 特别是高通量的检测方法 最近几年出现的生物芯片技术能较好地解决这一问题 生物芯片根据所载探针种类分为基因芯片和蛋白质芯片两大类 基因芯片以DNA为探针 依据核酸杂交的原理检测样品中的特定基因序列 蛋白质芯片以蛋白质为探针 依据抗原抗体反应的免疫学原理检测样品中的特定蛋白质 第三章常见食品添加剂的测定食品添加剂的种类繁多 22类 同一添加剂又有不同的分析方法 就具体的分析方法 食品不同 含量不同 甚多 但归纳起来主要有 滴定法 比色法 紫外分光光度法 荧光法 离子选择性电极法 色谱法 气相 液相 薄层 食品中添加剂的测定与食品添加剂的测定的方法又有区别 一个需要进行 前处理 分离 一个则不需要 加之含量差异 分析方法有的采用不同的分析方法 一 防腐剂的测定 一 碱滴定法测定苯甲酸1 原理样品加入饱和NaCI 在酸性条件下 用乙醚提取 去乙醚溶于中性乙醇 用碱滴定 2 方法 1 取样75g 7 5gNaCI 300ml烧杯溶解 2 加入70ml饱和NaCI 用10 NaOH滴至碱性 3 定溶250ml 摇 置2h 4 过滤 取滤液100ml 置分液漏斗中 用1 1HCI滴至酸性 用190ml乙醚分三次抽提 静置 5 放出乙醚层 用水洗至中性 放入锥形瓶中 回收乙醚 加入50ml中性乙醇 10ml水 3滴酚酞 用0 05mol LNaOH滴至终点 二 苯甲酸 钠 添加剂的测定 要求 含量 99 5 苯甲酸钠 99 铅计 重金属 0 001 鉴别 1g样 20ml40g LNaOH 加1滴100g LFeCl3生成赭色 加HCl 1 3 白色 黄色火焰钠 测定A 苯甲酸称样0 25g加入中性50 乙醇溶液25ml 2滴酚酞 用NaOH滴至粉红色b苯甲酸钠提要 HCl 苯甲酸钠苯甲酸 不溶于水 易溶于乙醚 用乙醚萃取生成的苯甲酸 排除干扰 据用HCl的量计算苯甲酸钠含量称样1 5g 25ml水 50ml乙醚 10滴溴酚蓝 用0 5MHCl滴定 当水层显淡绿色为终点 黄 紫蓝 pH 3 0 4 6 三 气相色谱法测定苯甲酸 山梨酸 及其盐类 P147 151 152 液相色谱法测定苯甲酸 山梨酸 糖精 P152 154 二 抗氧化剂的测定1 BHA 叔丁基对羟基茴香醚 的测定样品经石油醚萃取加入72 乙醇 使BHA转入乙醇相中 再与2 6 二氯醌氯亚胺 硼砂 缓冲 溶液的显色剂反应生成蓝色化合物 在 620nm处测吸光度A2 BHT 2 6 二叔丁基对甲酚 的测定用水蒸气法将BHT分离出来 溶解于甲醇中 甲醇液接收 加入邻联二茴香胺 另加亚硝酸钠溶液 生成橙红色化合物 用氯仿萃取 在 520nm处测吸光度A3 可用气相色谱法测BHA BHT 三 发色剂 亚硝酸盐 硝酸盐的测定1 亚硝酸盐的测定 P177 样品经沉淀蛋白质 除去脂肪后在弱酸性条件下 HCl 亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化 与盐酸奈乙二胺偶合生成紫红色染料 550nm处测吸光度A2 硝酸盐的测定 镉柱法 P179 180 样品经用蛋白质沉淀剂 亚铁氰化钾 乙酸锑 沉淀蛋白质 除去上层脂肪 过滤后 用饱和硼砂溶液作提取剂 得提取液 通过镉柱在氯化胺缓冲液中NO3 Cd CdO NO2 用盐酸奈乙二胺法 比色 测NO2 总量减去未经镉柱还原前的NO2 则得由NO3 还原产生的NO2 量 乘以换算系数1 232得硝酸钠 NaNO3 含量 四 漂白剂二氧化硫及亚硫酸盐的测定测定方法有比色法 滴定法 色谱法盐酸副玫瑰苯胺比色法 P170 A 亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成络合物 HgCl2SO3 2 Na2HgCl4 SO2 H2O HgCl2SO3 2 B 与甲醛 对品红作用生成紫红色络合物 聚玫瑰红甲基磺酸C 550nm处测A 五 食品合成色素的测定测定方法主要有 薄层层析法 高效液相色谱法薄层层析法在酸性条件下 用聚酰胺吸附水溶性合成色素 而与天然色素蛋白质 脂肪 淀粉等分离 在碱性条件下 用适当溶液 如乙醇 氨 将其解吸 用薄层层析法分离鉴别 与标准比较定性 测A定量 薄层层析分离及定性a薄层板 1 6g聚酰胺 0 4g可溶性淀粉 2g硅胶G 15ml水研匀 铺在玻璃板上 0 3mm厚 凉干 80 1h干燥器中b点样 用微量注射器或毛细管将样液点于薄层板上 离底2cm左右2cm线宽 2mm 成一条底边的线c展开 层析缸内放入展开剂 如苋菜红 胭脂红用甲醇 乙二胺 氨水 10 3 4 将薄层板下端浸入溶剂0 5 1cm左右 放约1h 色素明显分开 取出晾干d比移值Rf的测定 可用纸层析 层析纸 测定方法基本同上a b cRf Rf 与标准样液Rf比