DNA分子的电镜制样及观察12100201.doc

DNA分子的电镜制样及观察任春梅 洪亚辉 董延瑜 张学文 赵 燕（湖南农业大学生物技术系，长沙，410128）摘要 摸索了DNA分子的水展膜电镜制样方法与技术，在无旋转投影设备的条件下,直接用透射电镜观察到了DNA分子的线型结构关键词 脱氧核糖核酸；电子显微镜；观察分类号 Q-336 DNA是生物的遗传基础，提取DNA是进行生物遗传转化的首要步骤。我校植物遗传工程研究室从1987年开始摸索各种作物DNA的提取纯化方法，对水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等多种作物建立了完整的DNA提取、纯化和检测流程。为了使所提取的的DNA能更直观地展现在人们面前，我们于1990年10月，根据当时的条件，反复进行了DNA分子的电镜制样，在电镜下观察到了DNA分子的线型结构1 材料与方法1.1 材料供试材料为提取、纯化的水稻、小麦、玉米、高梁、平菇、茶树等作物的DNA1.2 方法1.2.1 玻片、镊子的清洁把玻片、镊子放在大烧杯中，加入适量的浓H2SO4处理20min，倒出浓H2SO4用自来水冲洗数次，再用蒸馏水洗35次，最后保存在95乙醇中备用1.2.2 铜网的清洁把铜网放在小烧杯中，加入适量浓H2SO4处理20min后，倒出浓H2SO4，加蒸馏水漂洗35次；加氨水中和残留的酸；蒸馏水洗数次；重蒸水洗2次；保存在95乙醇中备用。如果是用过的铜网，应先放入氯仿中浸泡20min，再按上述方法清洁1.2.3 Formar膜的制备（1） 配制o5聚乙烯醇缩甲醛氯仿液(简称Formar膜液)，室温下放置2d使其充分混溶。（2） 将膜液倒入干净烧杯中，另取一干净玻璃缸加满重蒸水。（3） 取一干净玻片垂直插入膜液中，数秒钟后取出。（4） 待氛仿挥发后，用锋利尖刀在玻片四周划痕。（5） 双手捏玻片垂直缓慢地插入重蒸水中，随着玻片的插入，膜脱落下来，浮在水面上。（6） 用干净镊子夹着铜网(铜网粗糙无光泽的一面朝下)，轻轻地逐个摆在漂浮的膜上。（7） 用大小适宜的干滤纸平放在膜上并快速地反向捞起铜网放在干燥器中干燥备用。1.2.4 水展膜法制样（1） 配制上相液和下相液。上相液的配制：在无菌小离心管中加入6molL醋酸铵10L， 50 mmolL的TrisHCl缓冲液(pH85)lOL。2mgmL 5mmolL EDTA(PH8.5)10L，2mgmL细胞色素C10L。加适量DNA和重蒸水使总体积为60L。DNA的最终浓度为0.22.0gmL。下相液为蒸馏水。（2） 展膜。取直径为8一l0cm的干净培养皿在其内壁四周涂上石蜡注满下相液。将一干净玻片斜放在培养皿上。一端浸入下相液，另一端放在培养皿边缘上。在下相液表面撤少许滑石粉。用微量取液器取20L上相液，在离下相液表面1cm处轻轻地滴到斜面玻片上。上相液顺着斜面缓缓流下，当触及到下相液的液面时上相液就很快形成一层单分子膜，单分子膜可以从滑石粉在液面被推开时而观察到。（3） 铜网捞取单分子膜。用镊子夹着铜网，使有膜的一面朝下。在下相液表面轻轻地粘一下，单分子膜即被吸附到Formar膜上。（4） 2醋酸双氧铀乙醇液染色10s。（5） 100乙醇脱水10s。（6） 在干燥器中风干。1.2.5 透射电镜观察、摄影因无旋转投影设备。没有用金属投影而直接在日立H604型透射电镜上观察，摄影。放大倍数为16万倍。2 结果与分析在电子显微镜下，10-6m左右大小的DNA分子是完全可以观察到的，但是由于这类大分子的反差弱，因此要象在溶液中那样保持完整的核酸分子的构型而不断裂是不容易的。自从Kleinschmidt (1962)提出核酸分子蛋白质单分子膜技术以来，在一定程度上保证了分子的完整性。核酸分子蛋白质单分子膜技术可分为展开法、扩散法和一步释放法。本试验采用的是展开法，其制样原理是，碱性球蛋白细胞色素c(或溶菌酶、核酸酶、胰蛋白酶)在溶液的表面上变性，形成网状结构的单层分子膜，该膜伸展开的多肽链不折叠。由于多肽链上侧链的碱性基团与DNA分子多核苷酸链上的酸性基团之间的结合作图，使DNA分子随着细胞色素C的伸展而展，并固着在蛋白质分子上，使三维空间构型的双链DNA分子沿着单分子蛋白膜的展开而变成二维空间构型。从我们的制样与电镜观察可以看到DNA的线型分子(见附图)。根据图中DNA分子的图像，初步分析如下：a 样品与背景之间的反差弱。因为DNA分子的基本元素主要是C，H，O，NP，这些元素对电子的散射能力差，致使样品与背景之间的反差弱。为了增加反差，常采用染色与旋转投影两项措施。本试验由于无旋转投影设备，直接将醋酸双氧铀染色的样品放在透射电镜下观察、摄影，所以样品与背景之间的反差弱。b DNA分子展开程度不同。附图1和附图2同是小麦DNA分子，附图3和附图4同为水稻DNA分子，展开程度却不同从图中可见，附图1与附图3的DNA分子展开较好，而附图2与附图4的DNA分子没有充分展开这主要是由于制样时，后者DNA浓度较前者高的缘故。c DNA的分子大小不同。DNA在提取纯化过程中，由于受多种因素的影响会发生部分断裂，产生大小不同的DNA分子。如附图5的玉米DNA图像可明显看出分子大小的差异。d 不同作物DNA线型分子的粗细不同。水稻、小麦的DNA线型分子较细，而玉米、平菇的较粗。这可能是由于DNA分子螺旋化程度不同所致。以上是采用水展膜法对DNA分子的电镜制样结果，在无旋转投影设备的条件下，直接观察到了提取、纯化的DNA分子的线型结构。从而进一步证实了我们所提取纯化的DNA分子的可靠性。参 考 文 献1 孙勇如主编遗传学手册长沙：湖南科学技术出版社19892 李向辉主编植物遗传操作技术北京；科学出版社19883 彭秀玲，袁汉英编著基因工程实验技术长沙：湖南科学技术出版社，19874 张景强主编生物电子显微技术广州：中山大学出版社，1987ELECTRON MICROSCOPIC SAMPLE AND OBSERVATION OF DNA MOLECULERen Chunmei Hong Yahui Dong Yanyu zhang xuewen zhao Yan(Department of Biologic Technology,HNAU,Changsha,410128)ABSTRACT The methed and the technique using electron microscope to sample DNA molecule with water unfolding film was discussed.In spite of no spinning projection,the thready stru