植物冷驯化的分子基础.doc

植物冷驯化的分子基础：启示从学习的CBF冷应答途径获得对于75周年发行植物生理学，我贡献了其中的一篇文章（Thomashow，2001） ，我强调了最近在识别基因在冷驯化角色过程的进步。据此，某些植物针对低无结冰温度的抗冻性增加。与此同时，大约20种拟南芥基因已被确定为冷调控，似乎它可能是相对容易的建模的低温转录调控网络。从那之后，主要是通过开发和使用微阵列和其他基因组工具，我们已经了解了这暴露植物低温触发高度复杂的监管程序导致的转录组的广泛重组。这些在低温条件下植物的基因变化包括数百种向上和向下调节与分裂的时间的不确定。（Fowler和Thomashow，2002; Maruyama等人，2004;汉娜等人，2005;沃格尔等人，2005;大野等人，2006;克利安等人，2007; 罗宾逊和帕金，2008）。从不同层面分析克利安等人的转录组数据。（2007）清楚地揭示了这些功能（图1A）并且由此引发了许多基本性问题。植物怎样感知低温？也就是说，有什么性质的结构可以类似于低温温度计？这个信息是如何处理激活的冷调节基因的第一波？什么是监管逻辑的基础低温的传递信息的基因网络？什么样的生物学功能，可类似于构成各种电路的基因网络的？目前，这些问题的回答还远远没有完成，但显著的见解已获得的。在这里，我将突出对这几个问题的说明，重点是拟南芥CBF在冷应答途径的进展。另外在这里冷驯化的其他方面所涉及的主题和信息引用了其他被发现的最新评论。（Chinnusamy等，2007;。盖伊等人，2008;彭菲尔德，2008; Galiba等，2009;华，2009）。CBF的监管枢纽确定总体“线路图”的低温调节网络将不会是一个小事。事实上，其中的1000多种基因是感冒引起的，有超过170 基因编码的转录因子（图1B）。据推测，所有这些转录因子在低温下一致的重新配置转录。然而，如在其他系统中已了解到那样，某些转录因子可作为主要的监管“枢纽”，它们控制了大量的表达基因和正在研究中有疑问的生物，如拟南芥CBF转录因子冷驯化这样构成的监管枢纽。拟南芥编码3种冷诱导CBF基因，分别为CBF1，CBF2和CBF3（Stockinger等人，1997;玛等人，1998; Medina等人，1999），也被称为DREB1b，DREB1C和DREB1A。（Liu等人， 1998）。这些基因分别相互连接在基因组中，密切相关的进行编码转录，属于AP2/ERF家族成员的DNA结合蛋白 CBF的蛋白质结合到存在启动子的CRT/ DRE调控元件靶基因，被称为CBF调节子，并刺激它们的转录。植物对低温（4）CBF的诱导基因的输送发生在大约15分钟，然后CBF的靶基因在约23小时后开始感应。 Vogel等（2005）发现，在302种基因中的85种（28） 被确定为冷诱导基因。 野生型植株在温暖的温度下，被诱导的CBF2在转基因植物生长中表达，这表明CBF冷响应途径在低温转录过程中起了主要作用。这可能是低估了CBF调节子的作用，假设在温暖的温度下CBF转录因子由自己是足以诱导靶基因的表达。不可否认的是，基因表达的组合调控在基因调控中是一个常见的主题（牧师等人，2009）。此外，我们发现CBF2表达导致下调的212个基因的8个（4）在低温下被抑制 （Vogel等，2005）。 这些启动子没有在CRT/ DRE元件，因此不会直接参与CBF的调控，但他们可能通过在转录过程中抑制诱导调节CBF表达的因子，从而成为CBF调控网络的一分子。 CBF监管枢纽在低温冻害下的作用CBF的调节子对植物的抗冻性具有重要作用，此最初的证据是发现拟南芥转基因植物组成型表达CBF1，CBF2，CBF3导致植物在不暴露在低温度的情况下增加抗冻性。（Jaglo-的Ottosen等人，1998;。Liu等，1998; Gilmour等人，2004）。Novillo 等。（2007）利用RNA干扰和反构建以下调CBF1and CBF3的表达，发现在低温下这种处理导致植物抗冻性跌幅约25至50。此外，汉娜等（2006）研究6种拟南芥在不同冷冻下的耐受性，发现CBF1和CBF2水平表达，以及基因构成CBF2调节子与抗冻性呈正相关。最后，阿隆索，布兰科等人。（2005）定量映射性状基因座（QTL），用于重组从之间的交叉产生的自交系两份加入它们不同的抗冻性能力，以适应新环境。佛得角群岛（CVI）和兰茨贝格万寿菊（LER），CVI比LER对寒冷条件的耐受性更差。总共对7个QTL进行了鉴定，其中FTQ4映射到CBF基因座，约20的抗冻性发生变化。从CVI那里得到的是携带FTQ4轨迹重组自交系对寒冷的耐受性都不强。结果发现，冷诱导CBF2基因（和三个已知的CBF调节子基因）在CVI植物中比在Ler的植物少得多，该启动子在CVI CBF2基因的区域与Ler的CBF2基因的启动子进行比较有1.6 kb的缺失。综上所述，得出的结论是QTL该启动子诱导CVI CBF2基因的缺失很可能是植物对于耐冻性的基本分子基础。 该研究主要总结了植物CBF监管枢纽在低温转录和调理抗冻性方面具有重要作用。但是，三个CBF基因的功能都相同吗？为了解决这个问题，Gilmour等人（2004年）在对比转基因拟南芥植物的转录（生态型Wassilewskija-2）的组成和表达中，发现CBF1，CBF2，CBF3每个转录因子对冷调节基因的表达的影响是相同的，并没有获得的证据可以证明某一种因子具有特殊的功能。与此相反，Novillo等（2004）却发现CBF2与CBF1和CBF3具有很大的区别。特别是，他们发现拟南芥（Columbia型）携带一个未激活的CBF2 T-DNA插入位点，比野生型植物的CBF1和CBF3表达有较高水平转录和更大的抗冻性，这正证实了两个非驯化和冷驯化的植物之间的差异。此外，他们还报告说CBF1和 CBF3诱导比CBF2早一点。从上面研究的这些结果，研究者提出了CBF2是CBF1和CBF3表达的负调节物和抗冻性的调节子，在达成结论前Gilmour等人（2004）和Novillo等（2004）的研究在不同的生态型或方法使用中存在明显冲突。对于后者，用花椰菜研究基因的过表达现象（在这些情况下花叶病毒35S启动子），不仅消除潜在的组织特异性的问题，而且还可消除在CRT/ DRE这三个CBF蛋白之间的结合亲和力潜在的细微差异。阿隆索布兰科等人（2005）在研究中指出，更让人难以理解的是，为什么自然变异CBF2下调导致抗冻性降低，而Novillo等（2004）在研究中指出该下调CBF2可提高植物的抗冻性，但同样，该系统是不同的。显然，有关CBF监管枢纽还有许多基本问题有待解决。 另一个基本问题是CBF调节子如何增加植物的抗冻性？很显然这是由多种机制共同参与完成的，但是具体的回答这个问题需要很多额外的学习。由于已在别处审查（Thomashow，1999;宋等人，2003;彭菲尔德，2008年）因此在这里所提到的，某些CBF调节子基因编码参与生物合成的酶冷冻保护剂有许多种，例如Suc，棉子糖和其他编码的亲水性抗冻多肽。通过保护膜和对严重脱水应激蛋白的发生冻结，所有这些至少说明了具有冷冻保护剂功能的出现。 但是，CBF的调节中枢的功能，涉及到超出冷冻保护剂的生产机制。拟南芥植物CBF1，CBF2，CBF3基因过量表达表现为生长缓慢，植株矮小和延迟开花等，（Liu等，1998;Gilmour等人，2004）。CBF过度表达的转基因植株在正常生长的温度生长很差并不感到稀奇，因为它们是被迫进行转录增长（Maruyama等。2004年Vogel等人，2005）和（Cook等，2004年Kaplan等人，2007; Usadel等人，2008）对于生活在低温下代谢的设计。但是，CBF表达的进一步观察效果是由阿查德等人发现。（2008年a）。这些研究者发现是什么导致CBF1表达组成DELLA蛋白一个积累小户型生长抑制的蛋白质，其实是部分的赤霉素（GA）信号通路（Harberd 等人，2009）。与生物正常水平的植物活性赤霉素相比，DELLA蛋白通过泛素 - 蛋白酶体途径降解。然而，当生物活性GA水平较低，DELLA蛋白积累，抑制生长，并导致植株矮小和延迟开花。阿查德等人（2008A）发现植物过量表达CBF1减少了具有生物活性的气体水平，而这是由于两个基因编码的遗传表达增加2 - 氧化酶，酶转化生物活性赤霉素为惰性赤霉素。活性赤霉素下降导致DELLA蛋白增加，从而导致植株矮小和延迟开花的表型。事实上，CBF1的组成型表达并没有直接导致在植物矮小和延迟开花，GAI和RGA分别运载的T6和RGA-24的突变，导致了两大DELLA蛋白的失活。 除了影响植物生长，DELLA蛋白活性被认为是植物获得完整的抗冻性所必需的。（阿查德等人，2008年a）CBF1在转基因植物中过量表达增加了植物的抗冻性，gai-T6和RGA-24的突变在温暖的温度下生长量约减少了50，此外，通过引入gai-T6和RGA-24的突变观察在冷处理的野生型植物增加的抗冻性减少大约50。这些结果，连同阿查德等其他人的报道（2008A），表明CBF监管枢纽是通过抑制植物生长影响GA信号转导途径的活性，并 且有助于增强植物对冷环境的耐受性。通过该机制的DELLA蛋白是否有助于增强植物抗冻性无法确定，但这可能涉及减少活性氧的含量物种（阿查德等人，2008年b）。此外，DELLA改变植物结构可能潜在地在该领域有助于生存。例如，已经观察到（罗伯茨，1990）该品种小麦（普通小麦）具有更大的越冬有一个更匍匐生长习性，这导致了被积雪覆盖的植物更大的机会和绝缘抗恶劣空气的温度。最后，增长DELLA诱导克制可能有广泛的在非生物胁迫耐受性的作用，因为基因突变失活在DELLA基因也降低高盐胁迫的耐受性（阿查德等人，2006）。上游CBF监管枢纽：感知低温及诱导CBF表达正如前面所提到，一个根本的问题就是植物怎样感知低温，怎样启动冷驯化监管程序进而增强植物的抗冻性;也就是说，植物低温感受器的性质是什么？一种解决这个问题的方法是要找出转录冷调节基因的启动子和检测系统如何通过改变转录因子的活性使其能够忍受低的温度。这种方法有大约两个冷感的性质提供线索通路控制CBF表达，其中一个包括翻译后蛋白修饰和其他的起始信号。 CBF3的主要正向调节因子是ICE1，基本绑定到多个螺旋 - 环 - 螺旋转录因子，目前在Myc基因的DNA调控元件CBF3启动和刺激CBF3转录（Chinnusamy等，2003）。ICE1的作用一直是广泛的实验检查（Chinnusamy等，2007; 华，2009），因此在这里只提到这两种形式转录后开始调控关键部分。该ICE1基因组成型表达，这表明冷诱导CBF3涉及低温度诱导活化的ICE1蛋白。Miura等的结果（2007）提供了强有力的证据表明事实正是如此，并且这是完成通过低温诱导SUMO化ICE1介导的SIZ1蛋白质，SUMO E3连接酶的活化过程。但是，由HOS1环指的E3连接酶介导泛素化和ICE1的退化被质疑。（Lee等人，2001; Dong等人，2006）。在正常生长的温暖的温度时，HOS1基因的表达和HOS1蛋白位于细胞质中，但植物暴露在低温时，HOS1定位到细胞核。因此，低温出现启动快速：激活和失活ICE1的一个周期激活ICE1由于SIZ1介导的SUMO化，其次是ICE1灭活由于HOS1介导 泛素化和降解。这些事件与CBF表达的“短暂”的性质是一致的; 低温诱导的CBF转录水平急剧增加，最多达到在约2至3小时（大于10倍），发现随后下降到温暖种植的植物的几倍以上。因此，SIZ1-HOS1系统似乎有助于CBF基因的微调表达，使上调系统而且还可以防止“失控”的诱导与潜在有害的影响。但是，这样的微调包括除了SIZ1-HOS1系统因素，作为功能丧失的突变HOS1不会消除CBF瞬时诱导的性质;极值水平的CBF3效果更大，并保持在植物携带HOS1较长时间基因突变 ，但仍然返回到那些在非训化植物中发现的水平（Lee等，2001）。仍然存在需要解决的主要问题是SIZ1-HOS1系统，并涉及到低温感受器是如何做低温控制HOS1的细胞定位，它是如何影响SIZ1的调解ICE1的SUMO化，如何SUMO化增加ICE1的活动的能力？ 另一道冷传感途径涉及钙。近20年前，奈特等人（1991）建立的植物暴露于低温中导致细胞质中钙含量的快速瞬态达到极值。随后的研究拟南芥冷调节基因表达（Knight等人，1996;。Tahtiharju等人，1997;汉瑞克森和Trewavas，2003年）和苜蓿冷诱导的钙尖峰联系在一起（紫花苜蓿; 蒙罗伊等人，1993;蒙罗伊和Dhindsa，1995）。例如，对于拟南芥属的研究表明该化学剂以减少钙离子涌入细胞质，受损冷诱导某些CBF调节子基因。冷诱导参与钙离子通道（s）钙内流还没有被确定，多尔蒂等（2009年）提出可能存在一个机制，钙的水平可能被感测和信息处理以诱导CBF基因表达。这些研究人员确定了在CBF2启动子可以传授低温诱导基因表达和表现的27-bp的区域，这活性是依赖于已知的DNA序列CG-1元件，所述结合位点为6 CAMTA（对于钙调蛋白结合的转录激活因子）蛋白由拟南芥编码（芬克勒等，2007）。此外，他们还发现27-bp的启动子片段所需CAMTA3功能基因。提出了一种可能性是，低温诱导导致了钙的快速增长，形成钙 - 钙调蛋白（钙调蛋白或类似的蛋白）CAMTA3复合物，促进转录靶基因。携带一个拟南芥camta3突变被发现在寒冷中被削弱感应CBF1，CBF2和ZAT12的（低温诱导转录本的积累被降低约50），所有这些都在CAMTA CG-1的DNA结合位点结合他们的启动子，这表明这些基因是直接由CAMTA3控制的。植物携带单camta3突变抗冻性并没有受损，但那些携带一个camta1/camta3双突变在低温下CAMTA转录中起重要作用。低温诱导的钙内流和 CAMTA介导的基因表达之间的变化须建立更多的研究，冷调节基因表达与CAMTA调节蛋白的关系确立需要我们更多的研究和更大的决心。 CBF的监管枢纽的生理节律在拟南芥冷驯化的许多研究中，包括大部分在我们的实验室中进行的，已经用在恒光生长的植物。以为是低温引起基因的表达的变化，不间断的光照增加了植物的抗冻性。以及低温调控网络这些变化确定的性质，白天效应，昼夜和光周期调控这些“复杂”的潜在因素，我们都不能予以忽略。然而，这样的还原论方法用于根据所述生物过程的复杂性学习会导致准确性降低，很多对系统重要的因素可能会被人们忽略。下面是冷驯化基因的表达。CBF3和某些CBF调节子基因在正常生长温度下是受生物钟调节的，恒光实验第一个发现可能漏掉影响冷调节基因表达的重要方面（哈默等人，2000）。这就出现一个问题，低温是否由CBF监管中枢控制并且受时钟影响的。事实证明，确实如此。如果拟南芥植物在一个12小时的光周期种植，然后转移到恒定光下，如果温度是在ZT4（天亮后4小时）比ZT16下冷感应CBF1，CBF2，CBF3增加很多。（Fowler等人，2005;即冷调节的CBF基因的表达是由时钟担任“门控”）。值得注意的是，CBF表达的昼夜门控现象也发生在番茄上面（龙lycopersicum; Pennycooke等人，2008），这表明这是一个高度守恒的形式并且是至关重要的调节规律。现在必须确定时钟和低温监管路径如何被集成和它们是怎样影响植物CBF基因表达的能力以应对寒冷的气温。最近Kidokoro等（2009）在这方面迈出了重要的一步，他们表明基本螺旋 - 环 - 螺旋蛋白PIF7是一种转录抑制因子，参与CBF1和CBF2的昼夜调节并且涉及PIF7与TOC1的相互作用，振荡器和PHYB，红光感光等是植物感知昼夜的一个重要组成部分。此外，应该指出的是胞质的水平在所控制的游离钙振荡生物钟（杜德等人，2005），而在反应低下所产生细胞内钙温度由时钟（杜德等人，2006）进行调控。正如上面提到的CBF1和CBF2的调节涉及到钙调蛋白结合CAMTA的动作转录因子（多尔蒂等，2009）。也许CAMTA蛋白质参与昼夜解码振荡和钙的低温门控，并有助于CBF基因调控和植物冷适应。 一个主要的结论在这个低温，生物钟和这种效应所产生的影响，在辨别寒冷适应基因中的相互影响已经由2008年Bieniawska的工作得出结论。这些研究员发现低温打乱了拟南芥的昼夜生物钟节律，而且这种现象很大程度上是很多变量共同影响低温条件下的转录组物，这在其他文献中也是如此。举例来说，当植物在16h的光周期下生长，被转移到低温条件的时候，那些调控昼夜节律的基因，例如PRR7，和那些调控生物钟同步的基因，例如CAB2，基因的转录水平被极大地激发了