实验小鼠痘病毒感染检测分析.doc

实验小鼠痘病毒感染检测分析应贤平钱琴屈霞琴姜文琴潘振业( 卫生部上海生物制品研究所 ,上海 200051)【摘要】 小鼠痘病毒急性感染可导致实验小鼠脱脚病 (鼠痘) 发作 ,临床症状明显 ,发病动物短期内大量死亡 。近 10 年某地区鼠痘发生次数依次为昆明小鼠 (7 次) 、NIH 小鼠 (3 次) 、ICR 小鼠 (2次) 和 BABLc 小鼠 (1 次) 。无明显临床症状慢性持续性感染 ( 隐性感染) ,是病毒传播或转化成急 性感染主要原因 ,用免疫荧光技术 ( IFA) 可检测到病毒抗体 ,鸡胚病毒培养意义不大 。流行病学调查证实 IFA 抗体阳性小鼠群体脱脚病发病率显著高于 IFA 抗体阴性小鼠群体 ( P 01001) 。【关键词】 小鼠 ; 鼠脱脚病 ; 感染性 ; 免疫荧光技术Analysis of Ectromelia ( Mousepox) Virus Infection in La boratory MiceYING Xianping ,QIAN Qin ,QU Xiaqin ,et al1( Shanghai Institute of Biological Products ,Shanghai 200051 ,China)【Abstract】 There were found Mousepox Virus (MPV) acute or chronic infection in laboratory mice . Sev2en ,three ,two and one acute infection of MPV occurred in Kunming ,NIH , ICR and BALBc mice respectively in near 10 years. MPV chronic persistent infection was demonstrated by immunofluorescence assay( IFA) . Both ret2 rospective and prospective epidemiological surveys confirmed that IFA positive was related to outbreak of Ec2 tromelia . IFA should be applied for monitoring chronic persistent infection of MPV in mice .【 Key words】 mice ; ectromelia ; infections ; immunofluorescence assay( IFA)素2小 鼠 痘 病 毒 感 染 有 急 性 和 慢 性 二 种 形式 ,常见实验小鼠烈性传染性脱脚病就是由 小鼠痘病毒急性感染引起的1 ,通常也称作为鼠痘 。故 把 小 鼠 痘 病 毒 称 为 脱 脚 病 病 毒( Ectromelia Virus) 或 鼠 痘 病 毒 (Mousepos Vir2us) 。慢性感染中主要为持续性感染 ,鼠痘病 毒慢性持续性感染小鼠没有明显临床症状 ,是诱 发 脱 脚 病 或 产 生 病 毒 传 染 的 主 要 因。因此对实验小鼠慢性持续性鼠痘病毒感染诊断对控制鼠痘病毒蔓延 ,防止脱脚病发生具有积极意义 。我们总结近 10 年来某 地区 11 个单位实验小鼠鼠痘病毒感染检测结果 ,初步分析鼠痘病毒慢性持续性感染免 疫荧光技术 ( IFA) 诊断方法具有较高灵敏性 和可靠性 ,为控制和预防脱脚病发生积累经 验 。1材料与方法作者简介 :应贤平 ,男 ,硕士 ,副研究员 ,研究方向 :实验动物病毒学把 1 ml 含 10 - 3 PFU111病 毒 抗 原 制 备Lister 株 痘 苗 病 毒 接 种 到 单 层 致 密 Vero 细胞 ,37 吸附 2 h 后 , 加 10 ml 含 1 %牛 血 清 MEM 细胞维持液 ,37 培养 3 d ,细胞出现明 显病变 、脱落 。按正常细胞与病毒感染细胞12 比例混合配制成 107 细胞ml ,滴加在圈有 26 孔玻片上 ,空气干燥后丙酮液固定 ,用 已知阳性血清测定抗原效价后 , - 80 保存 待用 。112血清病毒抗体检测 待查小鼠血清来自抽检和送检的普通级动物 ,阳性血清为自然暴发鼠痘 ( 脱脚病) 小 鼠群体中筛选得到的 , 阴性血清为本所 SPF 级小鼠血清 。待检血清按系列倍比稀释 ,加 到已感 染 痘 苗 病 毒 Vero 细 胞 吹 干 玻 片 上 ,37 湿温保持 45 min ,p H 712 PBS 缓冲液洗三次 ,凉风吹干后加异硫氰酸 ( FITC) 标记兔 抗小鼠 IgG 抗体或辣根过氧化酶 ( HRP) 标记 葡萄 球 菌 A 蛋 白 ( SPA ) , 37 温 温 保 持 45 min ,p H 712PBS 缓冲 液 洗 三 次 , FITC 染 色 的 玻片用甘油封片后在 Olympus 荧光显微镜下观察结果 , HRP - SPA 染色的玻片经 95 %酒 精脱水 、中 性 树 脂 封 片 后 在 Olympus 普 通 光 学显微镜下观察结果 。1 . 3病毒培养 把抗体阳性血清或疑有鼠痘病毒感染的小鼠 (高危群体) 血清或 110 稀释粪便 10 份 标本以上样品混合后过滤除菌 ,接种在 10 d 龄 SPF 鸡胚绒毛囊膜上 ,36 培养 3 d ,观察 绒毛膜上是否有痘斑病变 。痘苗病毒为阳性 对照 ,生理盐水为阴性对照 。114 流行病学调查回顾性调查 : 对暴发脱脚病普通致小鼠 动物来源 、饲养环境和发病状况等进行了解 后 ,对发病小鼠的来源鼠群进行血清学检测 和病毒培养抽样至少在 10 份以上 。选择同期无脱脚病症状同品系同等级相同数量小鼠 的来源鼠群作为对照 。前瞻性调查 : 对无任 何脱脚病症状而鼠痘病毒 IFA 抗体阳性普通级小鼠群体 ,调查其供应后或试验后动物发生脱脚病情况 。选择同期同品系同等级同数 量鼠痘病毒抗体阴性小鼠供应或试验后的状 况作为对照 。2结果211 临床症状和病理检查临床症状有结膜炎 、溃疡性睑炎 、脚和尾 部表皮结痂 、弓背松毛等现象 。发病动物在 短期内死亡 ,发病后期动物血清中可检测到病毒抗体 。尸解可见明显脾肿大并带有白色 斑点 ,肝脏肿大 、肝色变淡 、易脆 。病理切片 所见脾组织有多发病灶坏死融合 、结膜表皮 增生含有嗜酸性包涵体或肝脾组织中电镜下 观察到完整痘病毒结构作为确诊依据 。在开放饲养小鼠多次脱脚病发生过程中观察到试 验动物房小鼠最先出现脱脚病症状 ,约 12 周后育成小鼠群中发生脱脚病 ,最后可明晰 注意到配对育种公鼠发病母鼠不发病现象 。212 血清学检测结果在一次暴发脱脚病小鼠群体中鼠痘病毒 抗体检测结果 :暴发一周内抽检 20 只发病小 鼠 ,无一只抗体阳性 ( IFA) 。暴发第二周抽检 发 病 和 未 发 病 各 25 只 小 鼠 , 分 别 有 3 只(12 %) 和 2 只 (8 %) 抗体阳性 ,三周后群体小 鼠已基本发病死去 ,剩下 17 只症状不明显小 鼠 ,血清病毒抗体均阳性 ( 表 1 中血清编号 117) ,表 1 中编号为 18 22 血清是另外一 次脱脚病发生后采集的 ,共 22 份脱脚病后存 活小鼠血清中 ,最高抗体滴度可达 1640 ,最低只 有 1 5 , 仅 达 到 国 标 最 低 阳 性 判 断 标准3。免疫荧光技术 ( IFA) 检测抗体阳性率明显比 SPA 酶 联 技 术 ( SPA - EA) 高 。一 般IFA 抗体滴度大于 180 , SPA - EA 才可以检 出阳性结果 ,SPA - EA 抗体阳性检出率只有5415 % ( 1222 ) 。另 把 1 , 2 , 5 , 8 号 血 清 用011 %叠氮化钠 10 倍稀释送日本实验动物中 央研究所检测 , 结果 3 份 IFA 和 EL ISA 均阳性 ,1 份 (5 号) 只有 IFA 弱阳性 。表 1 IFA 和 SPA - EA 检测脱脚病存活小鼠 鼠痘病毒抗体比较Ta b. 1 Comparison between IFA and SPA - EA inectromelia survival mice等于 140 。表 2 不同单位鼠痘发生次数与IFA 抗体阳性检出率关系Ta b. 2Relationship between the ectromelia andIFA in different housesIFA 结果 ( 稀释度) SPA - EA 结果 ( 稀释度)血清编号IFA 检测次数 阳性次数 检出率 ( %)单位编号 鼠痘次数 Serum No . IFA ( dilution) SPA - EA ( dilution) housesectromeliaIFApositivefrequency ( %)+ (120)+ (140)+ (140)+ (1160)+ (15)+ (180)+ (1320)+ (110)+ (140)+ (180)+ (1160)+ (1160)+ (140)+ (120)+ (120)+ (1640)+ (1320)+ (180)+ (1160)+ (140)+ (1320)- (15)- (15)- (15)+ (15)- (15)+ (15)+ (110)- (15)- (15)+ (15)+ (15)+ (110)- (15)- (15)- (15)+ (120)+ (110)+ (15)+ (15)- (15)+ (110)12345678910111213141516171819202112343221131012975535318501041173313 5 1 7 2 2816 表 3 不同品系小鼠鼠痘病毒抗体检测结果与鼠痘发生关系Ta b. 3 Results of ectromelia and IFA in various mouse strains小鼠品系mouse数量阳性数检出率感染发生( %)次数 strains quantity positive frequency occurrence 昆明 KMNIH ICR BALBcC57BL671111690108305162007117511721220073210213病毒分离结果考虑到目前实验条件及环境因素 ,病毒 鸡胚培养分离只限于疑有鼠痘病毒感染的样 品 ,并且 IFA 结果阳性而无脱脚病症状的动物血清 11 份 、粪便 5 份 ,试验结果均阴性 。214流行病学调查结果为了进一步说明 IFA 抗体阳性与鼠痘病 毒慢性持续性感染及转化成急性感染关系 , 采用回顾性和前瞻性流行病学调查内容进行 分析 ,在发生脱脚病鼠群中 , IFA 抗体阳性检 出率 9213 % (1213) ,在统计学上非常显著大 22 + (180) + (15) 在无症状小鼠血清学调查中 ,每年按常规抽检比例对 11 个单位实验小鼠进行检测 ,有 5 个单位发现鼠痘病毒抗体阳性 。在这 5 个阳性单位中有 3 个曾发生过 2 次以上脱脚 病 ,脱脚病发生次数多的单位 IFA 阳性检出 率也高 (表 2) 。共抽检 1055 只小鼠 ,鼠痘病 毒抗体阳 性 检 出 率 平 均 为 516 % ( 591055) 。其中 昆 明 小 鼠 为 7117 % ( 51711) , NIH 小 鼠 为 5117 % (6116) , ICR 小鼠为 2122 % (290) , C57BL6 和 BALBc 小鼠未检出抗体阳性 ,阳 性检出率最高一次为 6215 % (2540) ,最低一次为 410 % (125) ,而统计鼠痘发生次数也依 次为昆明小鼠 、NIH 小鼠 、ICR 小鼠和 BALBc小鼠 (表 3) 。检测中 IFA 抗体滴度均小于和于无 脱 脚 病 鼠 群 IFA 抗 体 阳 性 检 出 率 ( 035) ,表明脱脚病发生可以产生鼠痘病毒抗体阳性 。在 13 次脱脚病中 ,有 1 次未检到 IFA抗体原因是动物发病一周内就被处理了 。表4 统计资料表明 IFA 抗体阳性鼠群脱脚病发 病率 6818 % (1116) ,非常显著高于 IFA 抗体阴性鼠群脱脚病发病率 5 % ( 240) ,说明 IFA抗体阳性与脱脚病发生有联系 。表 4 中 2 次IFA 抗体阴性动物群体发生 脱 脚 病 , 其 病 毒 传染源 很 可 能 是 外 界 带 入 后 急 性 感 染 造 成的 ,5 次 IFA 抗体阳 性 而 未 发 生 脱 脚 病 提 示 可能存在正常动物饲养供应系统范围内鼠痘病毒慢性持续性感染在一定时间可以不转化成急性感染 。表 4 IFA 抗体与鼠群脱脚病发生次数关系要消除鼠痘病毒感染仍需各方面努力 ,美国已多年未发生鼠痘病毒感染 ,被认为是 无鼠痘流行国家 ,是实验动物高质量一个重要标志 ,但在 1995 年一次实验中由于数只小 鼠人为注射了美国产含有鼠痘病毒小鼠混合血清 ,造成了整个动物房小鼠脱脚病流行1 。本文观 察 到 小 鼠 脱 脚 病 先 出 现 在 试 验 动 物房 ,然后 育 成 小 鼠 群 , 最 后 育 种 小 鼠 发 病 过 程 ,既符合外来病毒传染源首先带入试验动物房经过 ,又符合隐性感染小鼠实验诱发脱 脚病发 病 过 程 。虽 然 易 感 动 物 仅 为 实 验 小鼠 ,但由于实验小鼠品系繁多 ,从已报道结果 看不同品系小鼠易感性相差至少千万倍 。调查中 C57BL6 小鼠发病率低可能与国外报道 对鼠痘病毒感染有抵抗基因作用有关 ,昆明 种小鼠鼠痘发生率高可能与其远交群中基因有联系外还与群体使用数量多有关 ,BALBc小鼠对鼠痘病毒感染较敏感9 ,但在本文调 查中发病率和抗体阳性率均较低 ,原因有待 于进一步研究 。本文描述配对育种公鼠发病母鼠不发病现象是因为母鼠体内抵抗鼠痘病毒感染基因比公鼠多 ,这是一种性限制基因 作用 ,调节性限制基因最常见因素是生殖腺Ta b. 4Survey of IFA related to ectromelia组别groups发生脱脚病ectromelia未发生脱脚病no sign合计totalIFA 抗体阳性鼠群IFA positive colonies IFA 抗体阴性鼠群 IFA negative colonies1151623840合计total134356注 :2 = 26106 , P 01001 (2 = 101828 , P = 0 . 001)3讨论通常实验小鼠急性感染鼠痘病毒后第 3天就出现明显临床症状 、第 5 天动物就开始 死亡 ,急性感染动物血清抗体阳性率不仅低 ,而且滴度也不高4 。鼠痘病毒慢性持续性感染一般在免疫功能低下时发病或可被某些因 素激活产生脱脚病发作流行 。由于目前除实验小鼠以外的野生啮齿类或其它动物中均未分离到鼠痘病毒报道 ,鼠痘病毒自然宿主仍 然不清 ,病毒基因整合的潜伏性感染缺乏证据 。因此对实验小鼠鼠痘病毒持续性感染检测非常重要 ,本文部分血清送日本实验动物 中央研究所 Itoch 博士作 IFA 和 EL ISA 检测 , 结果基本一致 ,提示病毒抗体检测中目前是 以 IFA 最敏感 ,其次为 EL ISA , SPA 酶联玻片法较不敏感 ,只有在发生脱脚病存活小鼠中才能检测到阳性病毒抗体 。鸡胚培养方法对 检测鼠痘病毒持续性感染意义也不大 。国外已有报道应用 PCR 技术检测鼠 痘 病 毒 持 续9甾体激素 。即便存在鼠痘病毒慢性持续性感染 ,小鼠是否发病还依自然因素和人为因 素的作用 , 调查中也有发现 少 数 小 鼠 群 IFA抗体持 续 阳 性 但 无 明 显 脱 脚 病 症 状 状 况 存 在 。调查结果还提示曾发生过脱脚病动物饲 养场所经常规消毒处理后 ,饲养的小鼠经一定时间后再次发生脱脚病可能性较大 ,原因很可能是病毒污染物消毒不全面彻底 ,残留 的病毒可能又成为再次脱脚病的传染源 。完全改造或搬迁动物房可减少脱脚病的发生 。参 考 文 献Dick EJ , Kittel Cl ,Meyer H ,et al . Mousepox outbreak in a lab2oratory mouse colony. Lab Ani Sci ,1996 ,46602 - 611吴小闲 ,洪瑞珍 ,蒋虹 ,等 1 鼠痘 ( 小鼠传染性脱脚病) 的 流行形式和实验室诊断 1 中国实验动物学杂志 , 1996 ,12感染5 ,6,国内也有这方面尝试7 。赵雅静 ,宁磊 ,于风刚 1 小鼠痘病毒的聚合酶链反应检测法 1 上海实验动物科学 ,1998 ,1888Oneill HC ,Blanden RV1 Mechanisms determining innate resis2 tant to Ectromelia virus infection in C57BL mice , Infect Im2 mun ,1983 ,411391 - 1394Brownstein D ,Bhatt PN ,Jacob RO , et al . Mousepox in inbred mice innately resistant or susceptible to lethal infection with Ectromeli