第八章 基因工程寄生虫疫苗.ppt

第八章基因工程寄生虫疫苗 引起人体致病的病原生物分为两类 病原微生物 人体寄生虫寄生现象 在生物共生过程中 一方受益 一方受损的现象 寄生虫 一般指在生物共生过程中 营寄生生活的低等生物 寄生于人体的寄生虫称人体寄生虫 寄生现象 受益方 寄生物 受损方 宿主 一 寄生虫对宿主的作用 致病作用 机械性损伤 生物性损伤 化学性损伤 免疫反应性损伤 机械性损伤 破坏 压迫组织和阻塞肠道 化学性损伤 毒素作用 免疫反应性损伤 二 宿主对寄生虫的作用 免疫反应 一 非特异性免疫 又称先天性免疫1 皮肤 粘膜 胎盘的免疫屏障2 炎性细胞识别 吞噬作用3 体液因子的作用 补体 脂蛋白 二 特异性免疫 又称获得性免疫主要表现宿主对抗原识别应答的过程 二 特异性免疫1 消除性免疫宿主能消除体内寄生虫 并对再感染产生完全的抵抗力 临床上表现为完全免疫 比较少见 2 非消除性免疫指不能够帮助宿主完全清除体内寄生虫 但可对再感染产生一定作用的免疫力 这种免疫力可随寄生虫的清除而消失 包括 带虫免疫 伴随免疫 1 带虫免疫宿主感染寄生虫后产生获得性免疫 体内寄生虫未被清除 仍保持低密度水平 但宿主对再感染时侵入的同种寄生虫具一定的抵抗力 如 疟原虫 2 伴随免疫宿主感染寄生虫后产生获得性免疫 体内活的成虫不受免疫效应作用 但宿主对再感染时侵入的幼虫具一定的抵抗力 如 血吸虫 三 免疫逃避有些寄生虫能逃避宿主的免疫效应 而在有免疫力的宿主体内生存 增殖 这种现象称免疫逃避1 抗原变异虫体表面抗原的改变是逃避免疫效应的基本机制 非洲锥虫能有序地更换其表被糖蛋白 产生变异体 影响免疫识别 从而逃避特异性抗体的作用 2 抗原伪装虫体表面结合了宿主的抗原或被宿主的抗原包被 如曼氏血吸虫肺期童虫表面结合了宿主的血型抗原 妨碍了宿主免疫系统的识别 3 抗原释放寄生虫在宿主体内可释放大量可溶性抗原 并与抗体结合形成免疫复合物 干扰或抑制宿主的免疫反应 这种复合物能改变宿主免疫反应 如抑制嗜酸性粒细胞介导的对虫体的杀伤 抑制淋巴细胞转化等 4 破坏免疫效应分子寄生虫还能直接破坏特异的免疫效应分子 例如 枯氏锥虫的锥鞭毛体的蛋白酶能分解附着于虫体表面的抗体 使虫体上仅有Fab 部分 而无Fc部分 因而不能激活补体使虫体溶解 5 产生免疫抑制因子这种因子来自虫体或存在于宿主血液中 例如感染枯氏锥虫的小鼠血清中就有一种物质能在体内或体外激活抑制细胞而抑制抗体反应 引起全身性或局部性免疫抑制 第一节概述 人体寄生虫与人类共存的历史可追溯到远古 在漫长的岁月里寄生虫和宿主的关系经历了 史前期 形成期 和 确定期 据WHO统计 目前大约1 4世界人口受到五大寄生虫感染 疟原虫 血吸虫 利什曼原虫 丝虫 锥虫 要全面控制寄生虫病的流行 所面临的仍是一条漫长而艰辛之路 疟原虫 卵囊 合子 子孢子 裂殖子 配子体 配子 雄性 雌性 曼氏血吸虫 卵 毛蚴 尾蚴 成虫 雄虫 雌虫 锥虫 利什曼原虫 无鞭毛体 前鞭毛体 一 对寄生虫疫苗研究成功的关键1 包括选择免疫应答难以作用的寄生部位2 寄生虫在宿主体内不同发育阶段表现抗原特异性改变 从而使获得性免疫力有严格的阶段 或期 特异性 各阶段 期 因其不同的表面抗原而避开了前一阶段引起的宿主免疫效应机制的伤害 寄生虫表面抗原变异在锥虫 疟原虫 巴贝虫等致病性原虫表现更为明显 3 寄生虫在抗原变异 抗原摹拟和寄生虫摄入宿主DNA和获得宿主蛋白或以宿主抗原伪装自己方面也表现出非常复杂而有效的免疫逃避机制 但是 任何一种寄生虫在宿主体内长期存活的免疫逃避机制均未能完全搞清楚 仍是一个值得深入研究和探讨的课题 二 寄生虫疫苗的分类寄生虫疫苗研究始于1903年 至今洽好100年 可分类为 带低毒活野生型疫苗 自然界中分离的 致弱病原疫苗 减毒活疫苗 灭活或死病原疫苗亚单位疫苗 包括抽提物或代谢产物 合成的或重组的抗原疫苗抗独特型Ab疫苗DNA疫苗 三 寄生虫疫苗存在的问题迄今仍无公认的寄生虫病疫苗 究其原因 多数寄生虫为多细胞生物 寄生虫抗原成分非常复杂 很难找准特定保护性抗原 保护性免疫应答机制不清寄生虫抗原免疫所诱导的大都为部分保护性免疫力 一般为30 70 寄生虫形成种种逃避宿主免疫应答的办法 其机制尚待阐明寄生虫一般引起慢性长期感染 病期常因寄生虫在其生活史中形态的不同而存在许多阶段 所以寄生虫不仅存在种特异性 还存在不同阶段或期特异性抗原 成功的疫苗可能由多个特异性抗原蛋白组成 所产生的保护性免疫力需要保护一个以上的感染阶段 第二节基因工程寄生虫疫苗的研究现状 一 疟疾疫苗疟疾是流行范围最广的寄生虫病 人疟疾是虐原虫引起的地方性传染病 它是热带寄生虫病中最严重的一种 世界上每年3 5亿人口感染人疟 1 5 3百万人死于疟疾 大多数严重发病和死亡发生在儿童和孕妇 主要是恶性疟 由恶性疟原虫感染引起 其结果如下 疟原虫抗疟药的抗性呈上升趋势 媒介蚊对常用杀虫剂抗性的产生即所谓抗性蚊的出现和扩散 人口的迅速增长和人口流动 特别是对疟疾无免疫力人口迁移 使疟疾问题越来越严重 导致疟疾在世界范围持续地流行 一 疟疾及疟原虫1 疟疾疟疾是通过按蚊虫叮咬传播的寄生虫病 其病原体为虐原虫 疟原虫子孢子通过叮咬进入人体 经在肝脏发育繁殖引起的肝 脾及肾脏等器官的损害 疟原虫 人血 肝细胞内寄生繁殖 红细胞内繁殖 红细胞成批破裂 间歇性寒战 高热 大汗后缓解恶性疟发热不规则 常无复发 严重者可导致脑型疟疾 2 疟原虫疟原虫属于孢子虫纲 血孢子目 虐原虫属 是由按蚊传播的脊椎动物寄生虫 间日疟原虫 可复发 卵形疟原虫 可复发 三日疟原虫恶性疟原虫 临床表现重 生活史 两阶段无性生殖 人体内 有性生殖 蚊体内 两宿主中间宿主 人 终宿主 蚊 疟原虫生活史 红细胞外期 红细胞内期 主要致病阶段 配子体形成期 红细胞内期 环状体大滋养体裂殖体 大滋养体 红外期裂殖子侵入红细胞 环状体 裂殖体 含12 24个裂殖子 侵入新的红细胞 裂体增殖周期 裂体增殖使血液中的疟原虫得数量呈几何级数增长 每次破坏的红细胞数量也同步增长 经过几个周期后 每一周期的裂体增殖都会破坏大量的红细胞 从而引发疟疾发作 典型的发作症状可分为三期 寒战期 全身颤抖 甚至大热天 几床棉被加身也会寒冷哆嗦 约0 5 2小时 发热期 体温可高达40 以上 出汗期 在高热期后即大汗淋漓 体温恢复正常 病人此时自觉轻松 舒服 可安然入睡 疟疾由雌性按蚊传播防蚊 灭蚊十分重要 Don tgotobedwithamalariamosquito 不要和一只雌性按蚊同床 疟原虫复杂生活史的不同发育阶段中包括数种潜在保护性阶段 期 特异性抗原 为宿主有效免疫应答提供多个靶子 这些抗原是三种特定途径研究疫苗的基础 红前期包括肝期的子孢子疫苗或肝内期疫苗无性期天然血液期疫苗传播阻断疫苗 针对配子体 配子或蚊体内后期 被感染蚊接种的子孢子在血液循环1h后 进一步发育需入侵肝细胞 在细胞内增殖 或裂体增殖 随后释放数千裂殖子 入侵红细胞 因为单一子孢子感染能导致严重血液期感染 抗子孢子疫苗必须是100 有效才有实用价值 二 疟疾疫苗的分类根据虐原虫在人体的生活史 疟疾疫苗可分为3种 即抗红前期原虫疫苗 抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗 1 抗红前期原虫疫苗靶点 子孢子 感染的肝细胞子孢子疫苗 要达到100 的保护性 否则子孢子逃逸 重新感染最近报导了经较大改进的亚单位疫苗的免疫效果 他们用恶性疟原虫环子孢子蛋白结合经选择能加强免疫应答的佐剂制成抗原制剂 这种疫苗在大多数受试者产生对疟疾感染完全抵抗力及高水平抗子孢子抗体滴度 提示有一种与体液免疫相关的保护性作用 疟疾疫苗研制的策略之一是预防活疟原虫从肝内释放 这种疫苗很可能保护人免发疟疾的全部临床症状 约氏疟原虫 P yoelli 鼠疟模型所获结果表明 编码P yoeliiCSP或17kDa肝期和红细胞期蛋白的质粒DNA疫苗对诱导针对感染的肝细胞保护性的细胞毒CD8 T细胞应答是有效的 2 抗红内期原虫疫苗在虐原虫的生活史中 唯有红内期原虫能使人体致病乃至死亡 人们期望的红内期疫苗由两种 一种是完全有效的疫苗 这种疫苗能产生比天然感染更强的免疫保护力 另一种是有一定程度免疫保护力的疫苗 能使原虫血症控制在很低的水平 3 传播阻断疫苗传播阻断疫苗通过阻断虐原虫在蚊体内的有性生殖达到阻断疟疾传播的目的 因此 传播阻断疫苗的目的是预防蚊子变成传染性蚊 从而减少疟疾传播 已鉴定出许多对实验血吸虫病有保护性的抗原 这些抗原被WHO TDR认为是血吸虫疫苗最好的候选抗原 传播阻断疫苗另一个用途是对旅游者进行免疫 防止将虐原虫带回原地造成传播 三 疟疾疫苗研制的三个阶段1 第一阶段 减毒活疫苗阶段疟原虫子孢子蛋白辐射处理后 接种 可产生保护作用 主要针对于子孢子和肝细胞期疟原虫研究步骤 1 经辐射减毒疫苗产生免疫保护的机制的鉴别 2 引起这些保护性免疫反应的靶蛋白 寄生虫蛋白的识别 3 这些能产生保护性免疫反应的靶蛋白首先在齿动物身上进行试验 然后再过度到人体实验由于对大量人群进行此项实验尚有困难 于是设想研制亚单位疫苗 并使其产生的免疫保护作用与经辐射减毒孢子疫苗产生的免疫保护作用相似 2 第二阶段 亚单位疫苗满意的保护性抗原 或表位 组合在一起作为疫苗候选抗原 再进行其编码基因的克隆和表达 与单一成分的阶段 或表位 特异抗原疫苗比较 一种多成分 多阶段和多价的Pf疫苗将更为有效 3 第三阶段 基因疫苗基因疫苗一般由病原体抗原编码基因和以真核细胞作为表达载体的质粒构成 抗原编码基因可以是完整的一组基因或单个基因的cDNA 也可以是编码抗原决定簇的一段核酸系列 利用基因工程的常规方法 将目的抗原基因插入表达载体 真核质粒表达载体 在体外利用工程菌大量扩增 再分离纯化带有抗原基因的质粒DNA作为核酸疫苗 采用不同的方法将核酸导入体细胞 对这一项新的疫苗研究技术 它能全面诱导机体的体液和细胞免疫应答 此外 构建疟疾多阶段 期 多价 多表位复合基因DNA疫苗也取得一定进展 将疟原虫不同发育阶段 期 不同抗原的编码DNA序列 多价 拼接 从而拓宽宿主的免疫应答面 四 疟疾基因疫苗已问世 在欧美进行临床1 孢子体表面蛋白2 ssP2 基因疫苗孢子体表面蛋白2 ssP2 是一种含有826个氨基酸残基的保护性免疫靶抗原 孢子体表面和红外期正在生长的虫体膜上具有这种抗原 用于制备孢子体表面蛋白2基因苗 2 环子孢子蛋白基因疫苗环子孢子蛋白含有391各个氨基酸残基 孢子表面 虫体原生质膜和正在生长的红内虫体的空泡膜上都有广泛的分布 3 疟原虫蛋白17疟原虫蛋白17是一种相对分子质量为17000的蛋白质 存在于虐原虫感染过的肝细胞空泡和红细胞膜上 能被NYLS3单克隆抗体识别 五 疟疾基因疫苗的优点 1 激发机体全面的免疫应答 这种保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用 2 基因疫苗表达的抗原接近天然构象 抗原性强 3 制备简单 成本低廉 易进行规模化生生产 且运输保存方便 4 联合免疫 可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中 或将不同抗原基因的多种质粒联合应用 制备多价DNA疫苗 5 基因疫苗既有预防作用也有治疗作用 二 血吸虫病疫苗1 血吸虫病血吸虫病是一种慢性的 严重危害人民健康的人畜共患寄生虫病 世界上2亿人口受血吸虫病危害 每年约有50万人死于血吸虫病 日本血吸虫病是由日本血吸虫寄生在门静脉系统所引起的疾病 主要病变是由虫卵引起肝与肠的肉芽肿 人主要是通过皮肤接触含尾蚴的疫水而感染 急性期有发热 肝肿大和压痛 腹泻或排脓血便 血中嗜酸性粒细胞显著增多 慢性期以肝脾肿大为主晚期以肝脏门静脉周围纤维化为主 可发展为门静脉高压症 食道 胃底静脉曲张 巨脾与腹水 恶液质 腹水型 巨脾型 腹水型患者 江苏省武进县的晚期病人 2 血吸虫血吸虫是寄生于血管内吸虫的总称 属于裂体科 故又称裂体吸虫在我国流行的是日本血吸虫雌雄合抱寄生在肠系膜静脉 门脉系统产卵在肠系膜下小静脉末梢 门脉系统的入口 生活史 1 成虫寄生于人及多种哺乳动物体内 门脉一肠系膜静脉系统 以血液和血管内皮细胞为食物 虫体可逆血流移行到肠黏膜下层的小静脉末梢 雌虫在此处产卵 2 虫卵的去路和体内发育部分虫卵被血流冲入门脉系统的出口 肝组织内的小静脉末梢沉积在肝组织内形成虫卵肉芽肿和干线性纤维化 重度感染时 阻塞门脉出口导致 门脉高压肝脾肿大腹水上消化道出血等 3 虫卵随粪便排出体外 入水後很快孵出毛蚴 主动侵入中间宿主 4 无囊蚴期 尾蚴是感染阶段 二 血吸虫疫苗的分类可分为 虫源性疫苗 基因工程疫苗 核酸疫苗 合成多肽抗原疫苗 抗独特型抗体疫苗 1 虫源性疫苗包括死疫苗 活疫苗 活疫苗含异种活疫苗与同种活疫苗 后者包括射线和化学至弱疫苗 这些疫苗对宿主保护力较高 攻击感染後减虫率可达70 甚至90 以上但虫源性疫苗受到外源限制 不易保存 现场应用存在困难此外 免疫原所致病理损害和安全性问题限制了它的进一步研制和应用 2 基因工程疫苗已经筛选出10多个候选抗原 获得克隆和表达 多数进入动物实验阶段 3 核酸疫苗DNA疫苗研制工艺简单 可大量生产 成木低 贮藏方便 今年来国内由3家实验室进行了研制与动物实验 并取得了初步的抗感染效果 但其安全性仍受到人们的关注 4 合成多肽抗原疫苗通过对靶抗原氨基酸序列及其表位的分析 设计合成具有多个免疫效应位点的分子抗原肽 诱导了保护性反应 初步动物实验有较好的保护性效果 5 抗独特型抗体疫苗以抗病原生物的抗体作为抗原免疫动物 抗体的独特型决定簇可刺激机体产生抗独特型抗体 作为抗原的模拟物Ab2 免疫动物后 产生的抗Ab2独特型抗体就与抗原发生结合 从而产生保护作用 三 血吸虫疫苗研究的三个阶段 1 死疫苗研究阶段 采用不同的抗原制备方法 观察以成虫 虫卵 尾蚴及排泄分泌物等免疫后的抗攻击感染效果 2 活疫苗研究阶段 包括异种和同种减弱活疫苗免疫 采用辐射性至弱的活尾蚴 尽管免疫动物可以产生高保护性 但是由于潜在的危险性和生产困难 推广应用受限 3 分子疫苗研究阶段 基因工程可以大量生产重组抗原分子或具有保护性抗原表位的肽段 制剂纯度高 副作用小 为实验应用提供了保障 基因工程免疫的研究基础是确定保护性及其保护性表位 四 血吸虫基因疫苗1 血吸虫期特异性抗原基因免疫学研究表明 寻找阶段特异性抗原 特别是血吸虫未成熟期对宿主免疫力攻击最最弱的阶段特异性抗原是研制血吸虫疫苗的一种战略 未成熟或早期童虫是宿主免疫效应机制最适合的靶子的概念已为大量体外效应机制实验所验证 2 血吸虫特异性基因血吸虫雌虫绝对依赖雄虫才能发育成熟 从而提示血吸虫的性可影响血吸虫的生活史 设想找到一种途径 以减轻雌虫性成熟的程度或是产卵 将是一种有效的减轻血吸虫致病性的手段 若能完全抑制或阻断血吸虫产卵 则血吸虫的生活史将完全被阻断 3 血吸虫肌抗原基因97 103是脊椎动物的肌原纤维蛋白 是一种具有潜在疫苗价值的血吸虫非表面抗原 4 血吸虫酶性抗原基因酶性抗原作为日本血吸虫疫苗的候选靶抗原成分 是今年来研究较活跃的一个领域 已发现数种抗原性酶如酸性巯基蛋白水解酶 谷胱甘肽一S一转移酶等 目前 应用阶段和实验阶段的血吸虫基因疫苗有 1 副肌球蛋白是一种糖蛋白 位于日本血吸虫虫 尾蚴 童虫的肌肉层 2 照射减毒抗原Irv一5是曼氏血吸虫肌球蛋白片段中的一个相对分子质量为62X103的重组蛋白 重组的Irv一5能被紫外线至弱尾蚴免疫鼠血清识别 与慢性感染鼠血清也能发生弱反应 但免疫小鼠未取得免疫保护作用 3 磷酸丙糖异构酶 TPI 是一种参与血吸虫生命代谢活动的重要功能分子 催化磷酸二羟基丙酮分子二磷酸甘油醛之间的可逆反应 是血吸虫糖代谢的一个关键酶 4 脂肪酸结合蛋白基因 FABP 日本血吸虫FABP存在与雌虫食管分泌的溶血素溶解后释放处血红蛋白 血红蛋白被血吸虫肠管中的蛋白水解酶大量降解 5 卵黄铁蛋白基因是血吸虫雌虫特异基因的产物 在卵黄腺高水平表达 是一种具有性别和组织特异的发育调节蛋白 6 热休克蛋白 HSP 是生物在不利情况下产生的保护机体的蛋白 又称 看家蛋白 具有重要的的生理作用 如促进器官组织的正常发育 作为分子伴侣参与蛋白质的折叠 装备 降解 修复和转移 以保护细胞不受机体外环境不良条件的损害 7 新基因的发现将生物信息学技术 表达序列标签法和步移法测序相结合 构建cDNA文库 随机挑取重组阳性口令进行测序 对部分序列进行步移法测序 获取全长cDNA 对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较 从而获得新基因 五 血吸虫基因疫苗存在的问题 1 血吸虫存在免疫逃避机制血吸虫可以多种方式逃避的免疫攻击 包括获得宿主抗原 虫体表面抗原或表达丧失或抑制宿主免疫反应等 2 在动物模型和人体内的免疫机制差异虽然血吸虫抗原诱导的效应机制已在实验模型中得到了阐明 人类免疫效应的体外实验和流行病学调查结果也支持这些结论 但究竟那种动物模型的免疫效应更与人接近 仍不完全清楚 且由于实际的原因 要在人体体内阐明对血吸虫的获得性免疫是很困难的 3 免疫效应机制的选择诱导已知宿主体液的保护效应抗同一分子甚至同一表位时 效应抗体和阻断抗体可产生不同的免疫表达 影响宿主的最佳抗体的表达 4 抗原表位的鉴定鉴定血吸虫抗原普遍采用的是产生能被动转移抗性抗体或含T细胞丰富的脾细胞 但刺激体液免疫的抗原和刺激细胞免疫的抗原不一定一致 需鉴定 5 糖基表位已有研究表明多糖是未成熟虫卵和童虫的重要抗原 但由于分离纯化操作上的困难 有关血吸虫多糖的免疫原性的研究远不如蛋白质那样深 6 保护水平尽管已有多种天然的或充足的抗原分子在动物实验那种能诱导一定保护性免疫力 但现在还没有发现一种