显微操作技术 荧光显微镜技术的特点和应用.ppt

荧光显微镜技术的特点和应用 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 和传统显微技术相比 荧光显微技术具有以下优点 1 荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的波长短1 2 因此荧光显微镜的分辨能力超出了传统显微镜的分辨率的极限 2 荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性 它所用染料的量是极其微小的 只相当于传统显微技术中染料消耗量的几千分之一 3 荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成分 并且显示的彩色效果很明亮 极易观察 极易进行定量分析 而且能以极低浓度的染料检测出含量极微的物质 4 随着新的荧光染料的发明 可不断扩大被测物质的范围 生物学材料 有各种产生荧光 1 自发荧光 或原发荧光细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生荧光2 诱发荧光材料中的某些物质经一定的化学处理后 可转化为荧光色团 由此被诱发产生荧光 最常见的是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为荧光色团 戊二醛也能诱发荧光 3荧光染料染色 应用含荧光色团的物质作为染料 使与生物组织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合 即可被激发荧光 这类染料称为荧光染料或荧色素 许多常规染色剂 如刚果红 曙红 碱性品红 水溶性苯胺蓝等 兼有荧光染料的性能 1 DNA研究 用细胞荧光测定技术测量DNA 是荧光显微技术和细胞光度技术相结合的产物 标志着前者由定性向定量测定发展 吖啶橙 3 6 二甲胺基 吖啶盐酸盐 分子式C17H19N3 HCl ZnCl 分子量438 12g mol 是一种荧光色素 其检测激发滤光片波长488nm 阻断滤光片波长515nm 吖啶橙 染色原理 吖啶橙可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光 其激发峰为492nm 荧光发射峰为530nm DNA 640 RNA 它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间 而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上 在蓝光 502nm 激发下 细胞核发亮绿色荧光 约530nm 胞质RNA发橘红色荧光 580nm 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别 可发出不同颜色的荧光 与DNA结合量少发绿色荧光 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光 该染料具有膜通透性 能透过细胞膜 使核DNA和RNA染色 因此 在荧光显微镜下观察 吖啶橙可透过正常细胞膜 使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光 含RNA的细胞质显示橘红色荧光 DAPI DAPI即4 6 二脒基 2 苯基吲哚 4 6 diamidino 2 phenylindole 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料 最大吸收波长为358nm 最大发射波长为461nm DAPI 染色原理 DAPI为一种荧光染料 可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用 可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光 和EB相比 对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍 显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞 荧光显微镜观察细胞标记的效率高 几乎为100 且对活细胞无毒副作用 2 细胞壁研究 荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出方面 是用于鉴定细胞壁成分 研究壁形成和再生 以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化观察细胞壁的方法很多 如用专一的染料染色或利用纤维素的偏振光性质等 现在国外常用的方法是荧光增白剂染色 在4QOnm左右的激发光照射下观察细胞壁 纤维素 所产生的绿色荧光来判断细胞壁的有无 荧光增白剂染色 荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力 当前常用的荧光增白剂有ST M2R VBL ST开始被用于显示细菌 放线菌与真菌的细胞壁 在粘菌材料中 它被证明与纤维素和几丁质有亲和力胼胝质是一种以 1 3键结合的葡聚糖 在植物的筛管代谢 配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用 其合成 分解直接关系植物正常的生长代谢过程 胼胝质是一种以 1 3键结合的葡聚糖 在植物的筛管代谢 配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用 其合成 分解直接关系植物正常的生长代谢过程 3细胞生活力测定 荧光素双醋酸酯 FDA 是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料 其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异 FDA本身不产生荧光 也无极性 能自由渗透出入完整的细胞膜 当FDA进入活细胞后 被细胞内的脂酶分解 生成有极性的 能产生荧光的物质 荧光素 该物质不能自由透过活的细胞膜 积累在细胞膜内 因而使有活力的细胞产生绿色荧光 而无活力的细胞因不能使FDA分解 而无法产生荧光 活体染色vitalstaining将无毒或毒性较小的某种染料注入动物体内 可被机体内某些组织或细胞所摄取 称为活体 影响荧光的因素1 pH的影响带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液PH值有关 例如 在pH 7 12的溶液中苯胺以分子形式存在 会发出蓝色荧光 而在pH13的溶液中苯胺以离子形式存在 都不会发出荧光 同时所用酸的种类也影响荧光的强度 例如 奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强 2 温度的影响温度对荧光强度的影响较敏感 溶液温度下降时 介质的粘度增大 荧光物质与分子的碰撞也随之减少 去活化过程也减少 则荧光强度增加 相反 随着温度上升 荧光物质与分子的碰撞频率增加 使去活化几率增加 则荧光强度下降 3 荧光强度与溶液浓度的关系在稀溶液中 F KcF为荧光强度K 检测效率 由仪器决定 c为液体的浓度高浓度时 荧光物质发生熄灭和自吸收现象 使F与c不呈线性关系 4猝灭剂何为猝灭 由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁 从而降低了发光效率的现象叫做猝灭在荧光物质溶液中 加入某种化合物 使溶液的荧光强度显著降低 这种化合物称为猝灭剂 猝灭作用可能是由于一部分荧光物质分子M与猝灭剂Q作用而生成了配合物MQ 如配合