第七章 有机介质中的酶反应..ppt

1 第七章有机介质中的酶反应EnzymaticcatalysisinNon aqueoussystem 2 Contentsofchapter6 第一节有机介质中的酶促反应概述 第二节有机介质中酶促反应的条件 第三节有机介质对酶性质的影响 第四节有机介质中酶促反应的应用 Go Go Go Go Go Go Go Go Go Go Go Go Go Go 3 一 酶催化反应的介质二 有机相酶反应的优点三 有机相酶反应必备条件四 有机相酶反应的研究进展 第一节有机介质中的酶促反应概述 4 一 酶催化反应的介质 水是酶促反应最常用的反应介质 但对于大多数有机化合物来说 水并不是一种适宜的溶剂 因为许多有机化合物 底物 在水介质中难溶或不溶 由于水的存在 往往有利于如水解 消旋化 聚合和分解等副反应的发生 是否存在非水介质能保证酶催化 1984年 克利巴诺夫 Klibanov 等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究 他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用 获得酯类 肽类 手性醇等多种有机化合物 明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应 5 一 酶非水相催化的分类 1 有机介质中的酶催化指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应 适用于底物 产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用 酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象 所以能够发挥其催化功能 2 气相介质中的酶催化酶在气相介质中进行的催化反应 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应 由于气体介质的密度低 扩散容易 因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点 6 3 超临界介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反应 超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体 4 离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用 挥发性低 稳定性好 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性 立体选择性 键选择性等显著特点 离子液 ionicliquids 是由有机阳离子与有机 无机 阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类 7 1 非极性有机溶剂 酶悬浮体系 微水介质体系 用非极性有机溶剂取代所有的大量水 使固体酶悬浮在有机相中 但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性 含水量一般小于2 酶的状态可以是结晶态 冻干状态 沉淀状态 或者吸附在固体载体表面上 2 与水互溶的有机溶剂 水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系 酶 底物和产物都能溶解在这种体系中 3 非极性有机溶剂 水两相 多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂 高脂溶性 相所组成的两相体系 二 酶促反应有机介质体系 8 4 正胶束体系正胶束是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂 加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴 表面活性剂的极性端朝外 非极性端朝内 有机溶剂被包在液滴内部 反应时 酶在胶束外面的水溶液中 疏水性的底物或产物在胶束内部 反应在胶束的两相界面中进行 5 反胶束体系反胶束是指在大量与水不混溶的有机溶剂中 含有少量的水溶液 加入表面活性剂后形成油包水的微小液滴 不管采用何种有机介质反应体系 酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水 它们都对催化反应有显著的影响 9 10 二 有机相酶反应的优点 1 有利于疏水性底物的反应2 可提高酶的稳定性3 能催化在水中不能进行的反应4 可改变反应平衡移动方向5 可控制底物专一性6 可防止由水引起的副反应 7 可扩大反应pH值的适应性 8 酶易于实现固定化 9 酶和产物易于回收 10 可避免微生物污染 11 三 有机相酶反应具备条件 1 保证必需水含量 2 选择合适的酶及酶形式 3 选择合适的溶剂及反应体系 4 选择最佳pH值 12 四 有机相酶反应的研究进展 1 超临界流体中的酶反应2 仿水溶剂和印迹技术 13 1 超临界流体中的酶反应 1 概念 指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体 具有和液体同样的凝聚力 溶解力 然而其扩散系数又接近于气体 是通常液体的近百倍 超临界流体萃取具有很高的萃取速度 另外该流体随着温度与压力的连续变化 对物质的萃取具有选择性 而且萃取后分离也很容易 14 2 超临界流体的有关性质 A 超临界流体的P V T性质 15 B 超临界CO2指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点 临界温度31 1 临界压力7 28Mpa 时的状态 该流体具有无毒 无臭 不燃等优点 对多数酶都能适用 且产物易于分离 C 提高溶剂选择性的基本原则 第一 操作温度和压力在超临界流体的临界点接近 第二 超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近 16 D SC流体的溶解能力超临界流体的溶解能力与其密度有很大关系 而密度又受到体系温度或压力的明显影响 所以压力或温度的变化 就会直接改变其溶解能力 E 超临界流体的选定 萃取剂需具有化学稳定性 对设备没有腐蚀性 临界温度不能太低或太高 最好在室温附近或操作温度附近 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度 17 临界压力不能太高 可节约压缩动力费 选择性要好 容易得到高纯度制品 溶解度要高 可以减少溶剂的循环量 萃取剂要容易获取 价格要便宜 萃取剂必须对人体没有任何毒性 在医药 食品上使用 18 19 1 仿水溶剂体系 原理 酶在有机相中主要依靠必需水与酶分子间的氢键维持活性构象 因此可用二甲基甲酰胺 DMF 乙二醇 丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的水 以调节酶分子的柔性 从而影响酶的活性和立体选择性 2 仿水溶剂和印迹技术 极性添加剂对体系的影响 a 对反应体系内水的分配影响b 与蛋白质的直接作用c 对产物分配的影响 20 优势 利用仿水溶剂与酶形成氢键的能力 调节酶的柔性 提高酶的活力和控制酶的选择 还可以控制由水而产生的逆反应和副反应 21 2 分子印迹技术 原理 竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化 形成一种高活性的构象形式 而此种构象形式在除去抑制剂后 因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持 22 例 当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂 N Ac Tyr NH2 的水溶液中冻干出来后 再将抑制剂除去 该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍 但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同 23 第二节有机介质中酶促反应的条件 酶分子只有在空间构象完整的状态下 才具有催化功能 在无水的条件下 酶的空间构象被破坏 酶将变性失活 故此 酶分子需要一层水化层 以维持其完整的空间构象 必需水 essentialwater 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响 存在最适水含量 24 一 必需水 1 概念 紧紧吸附在酶分子表面 维持酶催化活性所必需的最少量水 注意 酶的活性是由必需水决定的 与溶剂里的水含量无关 25 非水介质酶催化反应的共识 微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的 因为水间接或直接的参与了酶天然构想中包括氢键 静电作用 疏水作用和范德华力在内的所有非共价相互作用 无水条件下 酶分子的带电基团和极性基团之间通过相互作用形成一种非活性的 封闭 结构 水的加入可以削弱这种相互作用 使非共活性的 封闭 结构 疏松 从而酶分子的柔韧性增加 并通过非共价作用力来维持酶的催化活性构象 即水充当了酶分子的 润滑剂 26 2 表征必需水作用的参数 热力学水活度 定义 在一定温度和压力下 反应体系中的水蒸汽压与相同条件下纯水的蒸气压之比 该参数直接反应酶分子上水分的多少 与体系中水含量及所用溶剂无关 含义 水在体系中的固相 酶 载体 液相 含底物的溶剂 和气相 液面上部的空间 之间进行分配 达到平衡时各相水活度相等 27 28 采用水活度作为结合水量的衡量有多个优点1水活度的大小能直接反映出酶分子结合水的多少2反微量水的低水有机溶剂体系是一个涉及含酶和载体的固相 含底物溶剂的液相和体系空间的气相等三相系统 可用各相的水活度相等的原则方便的表示或处理体系的平衡状态3可以在反应到达平衡时通过测定体系的气体湿度比较方便的测定出水活度 29 3 干燥酶的水合过程 1 与酶分子表面带电基团结合达到0 0 07g g 水 酶 2 与酶分子表面的极性基团结合 0 07 0 25g g 3 凝聚到酶分子表面相互作用较弱的部位 0 25 0 38g g 4 酶分子表面完全水化 被一层水分子覆盖 溶菌酶 30 4 影响酶需水量的因素 a不同酶需水量不同b 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同溶剂疏水性越强 需水量越少 水在溶剂和酶之间分配 31 不同种类的酶因为其分子结构的不同 维持酶具有活性的构象所必需的水量也不同 即使同一种类的酶 由于酶的来源不同 所需的水量也显著不同 例 在脂肪酶催化转酯反映中 根据脂肪酶对水的敏感程度可以分为 三种类型 32 33 为对水敏感型 当体系中不加水及水活度极低时 酶的催化活力接近于零 随着水活度的增加 酶的催化活性急剧上升 至最大值后 随着水的加入 酶的催化活性又逐渐下降 为范围敏感型 即在很低的水活度时 酶就具有一定的催化能力 而在最佳水活度附近 随着水活度的变化 酶的催化活性随之发生急剧变化 为水不敏感型 催化反应具有最佳水活度 但水活度对酶的催化活性影响不显著 酶的催化活性不会随水活度的改变而发生突跃式的变化 34 水的介电性高 有机溶剂中少量的 必需水 能够有效的屏蔽有机溶剂与酶蛋白表面某点之间的静电相互作用 使酶分子构象与结晶状态一致 即与水溶液中酶分子结构类似 如果溶剂的极性非常强 水的介电能力不足以屏蔽溶剂与蛋白分子之间的静电相互作用 或者溶剂的亲水性大于酶蛋白表面的亲水性 水脱离酶蛋白而进入有机溶剂时 酶蛋白分子的结构才会受到溶剂的影响 35 5 水对催化反应速度的影响 酶在有机介质中的催化活力要比在水溶液中低在非水介质中酶的水化作用不完全 水化程度低的酶有较高的结构刚性 酶分子内部流动性降低导致稳定性增加 但是结构上柔韧性的降低导致活性降低 36 当有机溶剂中酶含水量低于最适水含量时 酶分子的构象过于 刚性 而失去催化活性加入适量的水 能使酶活性中心的极性和柔性提高 从而使酶活急剧升高 再增加含水量时 非但不会增加酶的催化活力 反而会引起酶活力的降低 水含量对酶催化速度的影响 37 原因酶分子结构的柔性过大 酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化 引起酶分子结构的改变而使酶失去活性 水分子在活性位点之间形成水束 通过介电屏蔽的作用 掩盖了活性部位的极性 太多的水会使酶积聚成团 导致疏水性底物较难进入酶的活性部位 引起传质阻力 38 二 酶的选择 1 酶种类的选择应具有对抗有机介质变性的潜在能力 在有机介质中能保持其催化活性构象 1 酶粉 例如 有人研究a 胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应 发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加 化学修饰酶 例如 SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性 它对温度 pH 蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD 2 酶形式的选择 39 固定化酶 把酶吸附在不溶性载体上 如硅胶 硅藻土 玻璃珠等 制成固定化酶 其对抗有机介质变性的能力 反应速度 热稳定性等都可提高 40 三 溶剂及反应体系的选择 水溶性有机溶剂 甲醇 乙醇 丙醇 正丁醇 甘油 丙酮 乙腈等 水不溶性的有机溶剂 石油醚 己烷 庚烷 苯 甲苯 四氯化碳 氯仿 乙醚 戊醚等 1 非极性有机溶剂 酶悬浮体系 微水介质体系 用非极性有机溶剂取代所有的大量水 使固体酶悬浮在有机相中 但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性 含水量一般小于2 酶的状态可以是结晶态 冻干状态 沉淀状态 或者吸附在固体载体表面上 2 与水互溶的有机溶剂 水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系 酶 底物和产物都能溶解在这种体系中 3 非极性有机溶剂 水两相 多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂 高脂溶性 相所组成的两相体系 不管采用何种有机介质反应体系 酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水 它们都对催化反应有显著的影响 1 酶促反应有机介质体系 42 2 有机溶剂影响酶催化的方式 1 有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活 A增大酶反应的活化能来降低酶反应速度B降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键 使酶活性下降 C酶三级结构变化 间接改变酶活性中心结构影响失活 43 2 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活例如 氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化 原因在于氯仿是苯酚基的很好的猝灭剂 3 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用 强极性溶剂能溶解大量的水 倾向于夺取酶的必需水层而导制失活 疏水性溶剂夺去水的能力较弱 引起酶失活可能性较小 44 3 选择有机溶剂必须考虑因素 1 有机溶剂与反应的匹配性 相容性 反应产物与溶剂的匹配性 极性产物倾向于保留在酶附近 可能引起产物抑制或不必要的副反应发生 有机容剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度 一般选用2 lgP 5的有机溶剂作为有机介质为宜 45 溶剂参数 极性系数lgP P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数 它能直接反映溶剂的疏水性 极性系数越大 表明其极性越小 反之极性系数越小 则极性越强 研究表明 有机溶剂的极性越强 越容易夺取酶分子结合水 对酶活力的影响就越大 极性系数lgP 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用 46 相容性 例 在己烷中聚苯酚氧化酶催化反应中 极性的苯醌产物不溶于己烷 导致在酶周围的水层发生不需要的聚合 该聚合物缠住酶 降低酶活 而在极性更强的氯仿中 苯醌分配到主体溶剂中不会使酶失活 47 2 溶剂对于主反应必须是惰性的制剂 例 酯基转移反应涉及到醇对于酯的亲核攻击而产生另一种酯 如果溶剂也是酯 就会生成以溶剂为基础的酯 如果溶剂是醇 也会得到类似结果 3 必须考虑的其他因素 溶剂的密度 黏度 表面张力 毒性 废物处理和成本等 48 四 pH选择和离子强度的影响 1 pH选择在有机溶剂中酶的活性与酶干燥前所处的缓冲液的pH和离子强度相关 其最适pH与水相中酶的最适pH相同 pH记忆 49 pH记忆 A 有机溶剂不会改变酶蛋白带电基团的离子化状态 在有机溶剂的环境中 不会发生质子化及脱质子化的现象 所以酶在有机溶剂中的化学状态与从中提取该酶的水溶液中的化学状态保持相同 B 酶在有机溶剂中结构刚性的增加保持了之前水溶液中带电官能团正确的离子化状态 对酶的活性和稳定性都非常重要 50 2 离子强度影响 实验现象 随着冻干时用的缓冲溶液的离子强度增大 酶活会增大 51 第三节有机介质对酶性质的影响 一 稳定性二 活性三 专一性 52 一 稳定性 热稳定性提高 储存稳定性提高 53 结论 在低水有机溶剂体系中 酶的稳定性与含水量密切相关 一般在低于临界含水量范围内 酶很稳定 含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降 54 55 二 活性 刚 柔并存刚性 生物大分子结构的精确性柔性 生物大分子局部区域具有一定的可运动性 56 1 单相共溶剂体系中 有机溶剂对酶活性影响 1 有机溶剂直接作用于酶 2 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大 在最适浓度达到最大值 若浓度再升高 则活性下降 57 2 低水有机溶剂体系中 大部分酶活性得以保存 但也有某些酶活性亦变化 例 有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水浓度下的酶活性研究表明 酶活性随水活度大小而变化 在一定水活度下 酶活性随载体不同而变化 58 三 专一性 某一些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化 这是酶活性中心构象刚性增强的结果 有些在水中不能实现的反应途径 在有机介质中却成为主导反应 例 醇脱氢酶催化烷醇氧化为醛 在水溶液中辛醇是最佳底物 再反向微团包裹后则丁醇更快被氧化 59 第四节有机介质中酶促反应的应用 60 1 脂肪酶 位置选择性酯化反应 葡萄糖苷 6 O 酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂 它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到 61 2 脂肪酶 消旋化合物选择性酯化 以2 取代 1 3 丙二醇和脂肪酸为原料 在有机溶剂介质中用脂肪酶 CCL 或猪肝酯酶 PLE 催化酯化反应 可得到较高光学纯度的R 或S 酯 62 3 脂肪酶 内酯合成反应 羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下 发生分子内环化作用得到内酯化合物 内酯可继续反应形成开链寡聚物 内酯化产物形式主要取决于羟基酸的长度外 也取决于脂肪酶的类型 溶剂及温度等 63 4 生物柴油