第11章紫外可见分光光度法.ppt

10仪器分析法概述 1 仪器分析法采用较为特殊或复杂的仪器设备 通过测量物质的某些物理或物理化学性质参数或变化来确定其化学组成 成分含量或结构的分析方法化学反应非必须条件 化学法使用天平和玻璃器皿 基于化学反应平衡之上的试样分析方法 仪器分析方法的分类 光学分析法电化学分析法色谱分析法 分离分析方法 热分析法其它分析方法 质谱法 中子活化分析等 联用技术 光学分析法 电化学分析法 仪器分析法的特点 灵敏度高 检测限低 适合微量 痕量 超痕量的成分的测定 化学法适合常量分析 选择性好操作简便 分析速度快 易于实现自动化相对误差较大 较化学法准确性低 但在不断提高 需要比较昂贵的专用仪器 10仪器分析法概述 2 化学分析分离 沉淀 萃取 蒸馏定性 直接或通过简单的化学反应测量待测物 的颜色 沸熔点 气味 光学性质 拆射 反射 衍射等 以及在不同溶剂中的溶解特性定量 重量法 容量法 仪器分析分离 色谱技术和毛细管电泳定性或定量 利用物质原子 分子 离子等的特性 如光吸收和发射 电导 电位 质荷比 荧光结构 形态 状态分析及表征 定量分析 化学分析容量分析重量分析常量组分 准确度高 仪器分析微量 痕量组分 准确度较化学法差 而且不同方法之间差别较大 仪器分析中的定量方法 1 标准曲线法 最常用的定量方法 具体做法 采用相同的处理方式配制一系列已知浓度 c1 c2 cn 标准溶液和待测试样 cx 并保证c1 cx cn 在相同的条件下分别测定相应的信号坐标纸 直接绘出曲线 并在曲线上查得相应数值 最小二乘法 可获得曲线方程 软件做图 origin 兼备上述两者 例 吸光度法测定酚 A k w 自学绘图软件Origin 仪器分析中的定量方法 2 标准加入法 试样基体比较复杂时采用 仪器分析法 分类光学分析法电化学分析法热分析法其他分析方法如质谱法等色谱分析法 分离分析方法 联用技术 特点分析方法繁多 原理及可解决的分析问题亦不同 因此必须熟悉各方法的基本原理 仪器结构及方法适用性与特点总体来看 较化学法选择性好 灵敏度高 检出限低 适合微 痕 超痕量组分的测定 但准确性较差 与方法有关 不同的信号形式 除定量外 亦有极强的定性及结构 形态和状态分析与表征能力 分离效率高 适于复杂样品的分离分析 色谱法 仪器分析中的定量方法 1 标准曲线法 最常用的定量方法 具体做法 采用相同的处理方式配制一系列已知浓度 c1 c2 cn 标准溶液和待测试样 cx 并保证c1 cx cn 在相同的条件下分别测定相应的信号S1 S2 Sn 通常3 5 7个点 数据处理 作图软件给出图和具体方程式 根据方程求出试样含量 几点说明 通常应强制拟合曲线通过 零点 是否可用单标求出k 标准曲线法的缺点 有时也不过零点 准确度要求不高时可以 但要求标准试样与待测液浓度相近 样品组成复杂时 基体影响较大 仪器分析中的定量方法 2 标准曲线法 试样基体复杂时使用 具体做法 将一系列已知量的待测物分别加入到几等份样品中 配制成浓度为 cx 0 cx c1 cx c2 cx c3 且具有相同基体组成的标准系列 然后在相同条件测得相应信号S0 S1 S2 以浓度c与信号作图 再将直线外推至与浓度轴相交 即可求得试样中待测物质的浓度cx 不足 麻烦 适合少量试样 要求不高时 可采用单点加入法 10仪器分析法概述 3 分析仪器性能及表征 其它原则 分析速度 分析难度和方便性 对操作者的技能要求 仪器维护及实用性 分析测试费用 灵敏度 1 待测组分浓度 或量 改变时所引起仪器信号的改变 反映了仪器或方法识别微小浓度或含量变化的能力 该值越大 仪器或方法的灵敏度越高 InternationalUnionofPure AppliedChemists 即IUPAC推荐使用 校正灵敏度 或者 校正曲线斜率 作为衡量灵敏度高低的标准 仪器和方法的灵敏度描述 k1 k2分别为两条校正曲线的斜率 即灵敏度 但未考虑测定重现性影响 信号的组成 本底信号 没有试样时 仪器所产生的信号不可以消除 但是可以通过仪器的改善或适当的数据处理而减小 影响检测限的主要因素之一空白信号 当试样中无待测组分时 仪器所产生的信号 理论上可以通过选择适当的空白试剂而进行校准 当样品组成复杂 该值难以消除时 标准曲线法定量便会产生较大误差 检出限 Detectionlimit DL 在已知置信水平 可以检测到的待测物的最小质量或浓度 它和分析信号 Singnal 空白信号的波动 噪音 Noise 有关 或者说与信噪比 S N 有关 如图 只有当有用的信号大于噪音信号时 仪器才有可能识别有用信号 检出限的计算 1 测定空白样品 或浓度接近空白值 20 30次 求其平均值Sb及其标准偏差sb 则可分辨的最小信号通过校正曲线的斜率k 将最小待测物信号SDL转化为浓度值CDL 即 当置信度为95 时 K 3 检出限的计算 2 例10 2 以0 0500mg L 1的Co标准液 浓度接近空白值 在石墨炉原子吸收分光光度计上 每次以5 00mL与去离子水交替连续测定 共测10次 所得数据如下表 试计算该原子吸收分光光度计对Co的检出限 解 检出限体现了分析方法可能达到的最小检测浓度 但实际测定实际测定通常以10倍噪音偏差所对应的浓度作为测量时的最低浓度 称为定量低限 信噪比 S N 测定次数 n S 线性范围 linearrange 第十一章紫外 可见分光光度法UltravioletandVisibleSpectrophotometry 光学分析法概述 1 光学分析法根据电磁辐射与物质相互作用后产生的辐射信号或发生的变化 或根据物质发射的电磁辐射来测定物质性质 含量和结构的一类分析方法 是现代分析化学的重要组成部分 光学分析法概述 2 电磁辐射一种以极大的速度通过空间 不要任何物质作为传播媒介的能量 光 具有波动性和微粒性 光学分析法概述 3 光学分析法分类非光谱法 物质与电磁辐射的作用不涉及内部能级的跃迁 但辐射的某些性质 折射 散射 偏振等性质发生改变 如折射法 浊度法 旋光法光谱法 基于物质与电磁辐射作用时 由于物质内部量子化的能级之间发生跃迁产生的发射 吸收和散射现象而进行分析的方法 光学分析法概述 4 光谱法的产生与分类 发射光谱法 吸收光谱法 荧光光谱法 作用物质可以为 原子和分子 光学分析法概述 5 光谱 按照波长顺序排列的电磁辐射或把一种复合光按波长顺序展开而呈现的光学现象 波长 强度 按波长及测定方法划分按照光谱外形划分按照电磁辐射的本质划分按照能量传递形式划分 按波长及测定方法划分 表1电磁波的波长范围 表2光学光谱区 按照光谱外形划分 线状光谱 原子光谱 带状光谱 分子光谱 连续光谱 黑体辐射 按照电磁辐射的本质划分 原子光谱原子的外层电子能级跃迁分子光谱分子的外层电子能级 振动 转动能级跃迁X射线能谱原子内层电子能级跃迁 射线能谱原子核衰变 按照能量传递形式划分 发射光谱吸收光谱荧光光谱 二次发射 拉曼光谱 散射 光波谱区 跃迁类型与分析方法 11 1紫外 可见吸收光谱概述 1 UV Vis方法是分子光谱方法 它利用分子对外来辐射的吸收特性 UV Vis涉及分子外层电子的能级跃迁 光谱区在200 800nm UV Vis主要用于分子的定量分析 但紫外光谱 UV 为四大波谱之一 是鉴定许多化合物 尤其是有机化合物的重要定性工具之一 11 1紫外 可见吸收光谱概述 2 UV Vis光谱的形成运动的分子的外层电子 吸收外来辐射 产生电子能级跃迁 分子吸收光谱 激发态分子 样品分子 单色器 检测器 光源 I0 It 几种有机化合物的紫外可见吸收光谱图 11 1紫外 可见吸收光谱概述 3 定性基础 几种有机化合物的紫外可见吸收光谱图 UV Vis光谱与官能团之间的关系 a 胆甾醇 b 异丫丙基丙酮 11 1紫外 可见吸收光谱概述 4 定量分析基础 420440460480500520540560580600620640 1 00 50 标准曲线标准加入 样品池 11 2基本原理 11 2 1紫外可见光谱的产生11 2 2有机化合物的紫外可见光谱11 2 3无机化合物的紫外可见光谱11 2 4常用术语11 2 5影响紫外可见光谱的因素 11 2 1紫外可见光谱的产生 1 分子的能量 电子能量 振动能量 转动能量 核内能 平动能量 内旋转能 11 2 1紫外可见光谱的产生 2 Ee最大 1 20eV Ev次之 0 05 1eV Er最小 0 05eV 分子能够吸收的能量 紫外可见光谱为带状光谱 11 2 1紫外可见光谱的产生 3 溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种能级的细微变化 也会引起谱带的进一步加宽和汇合 当分子由气态变为溶液时 一般会失去振动精细结构 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 1 HCHO 成键轨道 反键轨道 非键轨道 n 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 2 各轨道能级高低顺序 n n n nm 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 3 跃迁 饱和烃类 远UV区 真空 难测定且无有用信息 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 4 n 跃迁 含杂原子 大多数在近紫外区无明显吸收 常作溶剂 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 5 跃迁 不饱和烃类 K带 可通过共轭效应使 max增大 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 6 n 跃迁 含不饱和杂原子 R带 苯吸收带 溶剂 异辛烷 E带 I E1 E带 K E2 精细结构B带 III 11 2 2有机化和物的UV Vis光谱 7 荷移光谱 分子内氧化还原 hv D A D A D e给予体A e接受体 谱带宽 吸收强度大 104 定量 11 2 3无机化和物的UV Vis光谱 1 荷移光谱 与有机物类似 电子从给体向与受体相联系的轨道上跃迁 发生在近紫外线区与可见光区之间 11 2 3无机化和物的UV Vis光谱 2 配位体场跃迁 d d f f 过渡元素的d或f轨道为简并轨道 Degenerationorbit 当与配位体配合时 轨道简并解除 d或f轨道发生能级分裂 如果轨道未充满 则低能量轨道上的电子吸收外来能量时 将会跃迁到高能量的d或f轨道 从而产生吸收光谱 研究配合物结构及其键合理论 无配场 八面体场 四面体场 平面四面形场 d轨道电子云分布及在配场下的分裂示意图 11 2 4UV Vis中常用术语 1 生色团含非键或 键电子 能吸收外来辐射引发n 和 跃迁的结构单元称为生色团 如 C C C N C O等 助色团含有孤对电子 可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团 称之为助色团 F CH3 Cl Br OH OCH3 NH2 NHCH3 N CH3 2 NHC6H5 O 11 2 4UV Vis中常用术语 2 末端吸收 11 2 5影响UV Vis光谱的因素 共轭效应空间效应pH的影响溶剂极性 共轭效应 1 稠环芳烃的UV Vis图谱 共轭效应 2 共轭效应 3 共轭效应 4 脂肪醛的 n 2 丁烯醛的 2 3n 3 空间效应 1 A HD CH2CH2CH3B CH3E CH2CH2CH2CH3C CH2CH3F 2 4 6 三丁基 空间效应 2 pH的影响 苯胺pKb 9 3 苯酚pKa 9 95 苯胺UV吸收光谱图 酸碱性导致物质结构发生变化 可见光区物质吸光与颜色的关系 互补 溶剂的影响 1 1 蒸气状态2 环己烷中3 水中 极性增大 吸收峰振动精细结构消失 溶剂的影响 2 溶剂极性对n 和 跃迁能量的影响 溶剂极性增大 n 吸收蓝移 例 丙酮 溶剂极性增大 吸收红移 例 异亚丙基丙酮 11 3紫外 可见分光光度计 1 基本部件 光源 单色器 吸收池 检测系统 稳压电源 光电管 光电倍增管二极管阵列 CCD 石英 紫外 可见玻璃 可见 棱镜光栅 紫外 氘灯可见 碘钨灯紫外可见 氙灯 光源 氘灯 160 375nm钨灯 320 2500nm氙灯 250 700nm 氘灯示意图 单色器 1 单色器 2 S DW D 线色散率倒数W 狭缝宽度 S 单色光 的带宽 检测器 光电转换器 将光辐射转化为可以测量的电信号的器件单道检测器 光电管或光电倍增管多道检测器 二极管阵列 线检测器 或CCD面检测器 光电倍增管 PMT 优点 高灵敏度 响应快 适于弱光测定 甚至对单一光子均可响应缺点 对外加电压变化极为敏感 必须严格控制电压 热发射强 暗电流大 不适合在温度波动较大或高温下工作 不得置于强光 如日光 下 否则可永久损坏PMT 11 3紫外 可见分光光度计 2 扫描型非扫描型 722型分光光度计 单光束非扫描型 VarianCary1E紫外可见分光光度计 可消除光源不稳定误差以及样品池的差异 11 3紫外 可见分光光度计 3 其它类型的UV Vis分光光度计多通道仪器 MultichannelInstruments 光电二极管阵列photodiodearrays PDAs 电荷耦合器件 CCD 纤维光度计 HP8452A多通道二极管阵列分光光度计 纤维光度计 吸光度的测量 1 吸光度的测量 2 单光束仪器 选用光学性质相同 厚度相等的吸收池分别盛入参比溶液和待侧溶液 调整仪器使透过参比溶液的透光率为100 以此光强作为入射光I0 然后进行测定 双光束仪器 参比池与样品池同时放入 直接测定 baseline 常用溶剂的光学透明区 大于以上波长时使用 对溶剂的要求 1 低极性2 溶解被测物3 稳定4 在样品的吸收光谱区无明显吸收 11 3紫外 可见分光光度计 4 校正当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移 因此需要对其进行校正 波长标度校正 光源法校正 氘灯 486 00nm 656 10nm 使用镨 钕玻璃 可见光区 和钬玻璃 紫外光区 进行校正吸光度标度校正 采用K2Cr2O4标准液校正 在25oC时 于不同波长处测定0 04000g L的KOH溶液 0 05mol L 的吸光度A 调整光度计使其A与标准值对应 11 4定量分析 11 4 1定量依据11 4 2定量方法11 4 3显色反应11 4 4定量分析条件的选择11 4 5其他定量方法 11 4 1定量依据 1 Lambert Beer定律 A 无量纲 L mol 1 cm 1l cmc mol L 1 存在多个吸光物质时 吸光度的加和性 与L B定理相关的几个术语 吸光度A 透射比T与浓度c的关系 T 0 1 A 0 摩尔吸光系数 物理意义 当吸光物质浓度为1mol L 1 液池厚1cm时 一定波长的光通过溶液时的吸光度值 是物质本性决定的 表示灵敏度 5 105 高 L mol 1 cm 1l cmc mol L 1 Lambert Beer定律的适用性 适用条件 待测物为均一的稀溶液 气体等 无溶质 溶剂及悬浊物引起的散射入射光为单色平行光局限性 样品吸光度A与光程l总是成正比 但当l一定时 A与c并不总是成正比 即偏离L B定律 这种偏离由样品性质和仪器决定 样品性质影响 待测物高浓度 吸收质点间隔变小 质点间相互作用 对特定辐射的吸收能力发生变化 变化 试液中各组份的相互作用 如缔合 离解 光化反应 异构化 配体数目改变等 会引起待测组份吸收曲线的变化溶剂的影响 对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响胶体 乳状液或悬浮液对光的散射损失 待测样品在测定波长下发荧光或磷光在高浓度的电解质溶液中 折射指数发生变化 亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱 a 6 36 10 6mol Lb 1 27 10 4mol Lc 5 97 10 4mol L亚甲蓝阳离子单体 max 660nm二聚体 max 610nm 仪器因素 稳定性和非单色光 假设入射光由测量波长 x和干扰 i波长组成 据Beer定律 溶液对在 x和 i的光的吸光度分别为 当 x i时 或者说当 x i时 有A xbc 符合L B定律 当 x i时 或者说当 x i时 则吸光度与浓度是非线性的 二者差别越大 则偏离L B越大 当 x i 测得的吸光度比在 单色光 x处测得的低 产生负偏离 反之 当 x i 则产生正偏离 测定波长的选择 在 max处 灵敏度高 单色性好 11 4 2定量方法 标准曲线法标准加入法直接计算 已知 比较法单次标准加入法比色法 仅限有色物质 例 市售Vc片中Vc含量的测定 已知Vc可以在pH5 6及EDTA存在的的溶液中稳定存在 1 待测试样的准备 准确称取研细后的Vc片40mg 用pH5 6的HAc NaAc EDTA液溶解并定容至100mL 再移取10mL 用相同稀释至100mL 2 标准系列及待测试液的配制 与6个50mL容量瓶中分别加入Vc标准溶液 50mg L 1 2 00 4 00 6 00 8 00 10 00mL和10 00mL待测液 用HAc NaAc EDTA液稀释至刻度 3 吸收曲线的绘制 采用1cm的比色皿 以HAc NaAc EDTA液为参比 测定标准系列中的第四号在230 310nm下的吸光度 4 标准曲线的绘制及待测试样测定测定微量的铁 11 4 3显色反应 1 显色剂的选择原则 组成恒定 配合物稳定 显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大 max 60nm 等 提高灵敏度和选择性 例 浅黄 无色 血红 显色剂种类 无机 SCN MoO42 H2O2 有机 11 4 3显色反应 2 蛋白质总量的测定直接测定 max 280nm 存在核酸等干扰 灵敏度低 显色反应法 双缩脲法 Lowry法 考马氏亮蓝法 溴甲酚绿和溴甲酚紫法等 磷酸介质中 与蛋白结合前后 max从465nm红移至595nm 11 4 1定量分析条件的选择 1 仪器测量条件显色反应条件参比溶液的选择干扰及消除方法提高灵敏度及选择性的方法 仪器测量条件 1 0 2 2 A 0 434 仪器测量条件 2 当T 36 8 A 0 434 Er最小在实际工作中 应控制T在10 70 A在0 15 1 0选择合适波长 max 狭缝宽度 显色反应条件 1 显色剂用量配位数与显色剂用量有关 在形成逐级配合物 其用量更要严格控制 通常是固定其它反应条件 cM和pH等 改变cR来获得最佳浓度范围 显色反应条件 2 显色反应pH配位数和水解等与pH有关 通过实验确定 pH1 pH pH2 显色反应条件 3 确定显色温度及显色时间 如存在其它影响条件 也应采用相同得实验方法确定最适条件 参比溶液的选择 溶剂参比 试样组成简单 共存组份少 基体干扰少 显色剂不吸收时 直接采用溶剂 多为蒸馏水 为参比 试剂参比 当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时 采用试剂作参比 不加待测物 试样参比 如试样基体在测定波长处有吸收 但不与显色剂反应时 可以试样作参比 不能加显色剂 平行操作溶液参比 用不含被测组分的试样 在相同条件下与被测组分进行同样的处理 然后做为参比 例 采用邻二氮菲显色法测定水中微量铁的过程是 首先加入醋酸缓冲溶液保持pH在4 5之间 然后加入盐酸羟胺将水样中的三价铁还原为二价铁 再加入邻二氮菲显色 请问参比溶液应该如何选取 干扰及消除方法 1 选择合适的测定波长 钍 偶氮砷III 钴 亚硝基红 干扰及消除方法 2 掩蔽法 测Co2 调节pH 测定Fe3 Fe3 Cu2 FeSSal 紫红 Cu2 pH2 5 Ssal 干扰及消除方法 3 利用生成络合物稳定性的不同 Co2 的测定 Co2 Zn2 Ni2 Fe2 CoRZnRNiRFeR CoRZn2 Ni2 Fe2 钴试剂R H 分离 CO2 Ni2 离子交换树脂 双波长或导数光谱法 提高灵敏度及选择性的方法 合成新的高灵敏度有机显色剂采用分离富集和测定相结合采用三元 多元 配合物显色体系分子截面积增大 电子跃迁几率增大主要类型 三元离子缔合物 三元混配配合物 三元胶束 增溶 配合物 11 4