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文档简介

石蜡包埋组织样品制备方法 组织采集后，经固定、保存、石蜡包埋、切片、展片、烤片，方可进行HE染色（或其它化学染料染色）及免疫抗体标记。以下操作依据组织大小及致密程度而定1、组织的采集、固定和保存：可依据实验目的及组织的特点而考虑采用不同的固定和保存方法。此处只介绍实验室常用方法。采取组织后，4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜，PBS缓冲液洗三次，每次10min至1小时，于30%、50%乙醇中各10 min至1小时，4C保存于70%乙醇中。2、组织的包埋、切片、展片及保存： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10mm，贴于处理过的干净载玻片上，34C烤片过夜，之后收集于载片盒中，4C密封保存。 石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品 80%乙醇 15 min 95%乙醇 15 min 100%乙醇 15min 2 1/2乙醇1/2二甲苯 15 min 二甲苯透明 5-10 min 1/2二甲苯1/2石蜡 30 min 石蜡（1） 1.5hr 石蜡（2） 1.5-2.5hr 石蜡（3） 包埋4C保存3、石蜡组织切片的免疫标记：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，即可进行免疫反应，操作步骤与冰冻组织切片的反应方法相同。石蜡组织切片脱蜡、复水步骤： 密封保存于4C的组织切片 二甲苯(1) 10 min 二甲苯(2) 10 min 二甲苯(3) 10 min 1/2二甲苯1/2乙醇 15 min 100%乙醇 5 min 95%乙醇 5 min 80%乙醇 5 min 70%乙醇5 min 50%乙醇 5 min 30%乙醇 5 min d2H2O 5 min4、石蜡组织切片的HE染色： 切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，于苏木精中室温染色5-20 min，迅速用水冲洗切片，至组织切片变蓝，镜检。用0.1-0.5%盐酸乙醇分色12秒钟，也可用50ml H2O中加一滴氨水分色，效果亦好（如染色程度恰好，也可省略分色步骤）。之后用流水冲洗切片，直至切片变蓝，此称蓝化。切片经梯度乙醇至95%乙醇中，于0.5%伊红中染色15秒或更长时间，95%乙醇洗去残色，若颜色太深，可在低浓度的乙醇中脱色，镜检。无水乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。普通光镜观察，室温干燥条件下保存染色切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水 苏木精 室温5-10 min H2O 迅速冲洗 0.1%盐酸乙醇 1-2 sec 流水滴洗 30%乙醇 1 min 50%乙醇 1 min 70%乙醇 1 min 80%乙醇 1 min 95%乙醇 1 min 伊红A液 1min 伊红B液 1-30sec 无水乙醇 1 min 无水乙醇 5min 2 1/2乙醇1/
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