石蜡切片方法.doc

石蜡切片方法1 实验用品 1.1 器材 切片机，刀片，恒温箱，镊子，单面刀片，小台木，酒精灯，包埋纸盒，染色缸，蜡杯。 1.2 试剂 中性甲醛固定液，Harris苏木精，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇分化液，各级酒精（50%、70%、85%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 中性甲醛固定液：40甲醛120 ml，蒸馏水880 ml，磷酸二氢钠4 g，磷酸氢二钠13 g Harris苏木精：苏木精1 g，无水乙醇，10 ml， 硫酸铝钾，20 g，蒸馏水，200 ml，氧化汞，0.5 g，冰醋酸，8 ml分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。至少存放2星期才能使用。 1%伊红酒精溶液： 伊红1g溶于100 ml95%酒精溶液。 1%盐酸乙醇分化液 ：盐酸 1份 ，70%酒精 100份 甘油蛋白贴片剂：蛋白 50 ml ，甘油 50 ml ，水杨酸钠或麝香草酚（防腐剂） 1g 配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠或麝香草酚）作防腐用。4可保存几个月。 2 实验步骤2.1 取材 在满足试验前提下，所取组织块大小应不大于1.51.5 cm，厚度不超过0.5 cm。力求小而薄。 力求组织材料新鲜，避免组织细胞自溶。2.2 固定 24小时固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 2.3 流水洗涤过夜2.4 脱水 50酒精1 h，70酒精50 min，85酒精40 min，95酒精30 min，无水酒精30 min，无水酒精20 min。2.5 透明 无水酒精、二甲苯等量混合液30 min，二甲苯20 min，二甲苯20 min。 2.6 透蜡 放入二甲苯和石蜡各半的混合液30 min，再放入石蜡、石蜡透蜡各4050 min。 透蜡时间根据组织可延长。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在65 左右（比石蜡熔点高3 左右，做免疫组化试验应尽量使用低熔点石蜡），注意温度不要过高，以免组织发脆。2.7 包埋 从温箱中取出盛放纯石蜡（石蜡一般要事先熬几个小时，如有杂质要过滤）的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，轻轻将纸盒两侧的把手提起，将纸盒底部浸入水中，使底部稍微凝固。取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子（酒精灯烤热）夹取材料于纸盒底部，并摆放整齐。将纸盒慢慢地平放在水盆中，待上层形成一层薄膜时，立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30 min）后即可取出备用。 2.8 切片（20 最为适宜） 石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长方形，组织四周留下23 mm宽的石蜡。点燃酒精灯，然后用烤热的蜡铲放在台木和蜡块之间，利用蜡铲的温度熔化两者的蜡，把蜡块粘附在台木上。 整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行 切片的方法：将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口。调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度。调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般4-6微米。一切调整好后就可以切片。此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提起。切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在牛皮纸上（注意：靠刀面的一面较光滑朝下）。2.9 贴片 取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，加以涂抹。 滴12滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片粗糙面朝下。 在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。 2.10 脱蜡复水 石蜡切片经二甲苯、脱蜡各510 min，然后放入100%、95%、85%、70%、50等各级酒精溶液中各35 min，再放入蒸馏水中3 min。 2.11 染色 切片放入苏木精中染色约20 min。 分化 ，将切片放入1%盐酸乙醇分化液中约数秒至数十秒钟。如果染色适中，可取消此步骤。 95酒精35 min， 用0.5%伊红乙醇液复染3 min。2.12 脱水，中性树胶封片95酒精35 min，100酒精1015 min，中间换一次酒精。二甲苯3 min，中性树胶封片。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。 在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片