自写技术 Western Blot.xls

Western Blotting 1 样品的制备 另 1 1细胞 1 2蛋白 1 3 Sample Buffer 样品 1 1 事先调整100 水浴箱 配好后 水温到位 进 行水浴 100 30min 2 制胶 分离胶 10ml 2 1准备 10min 抄写配方 准备试剂 dH2O ml 准备制胶板 注意规格匹配 并洗干净 一定 不能留有痕迹 丙 烯 酰 胺 30 ml 2 2配胶 90min 依配方进行配置 用量约 分离胶5ml 板 浓缩 胶3ml 板 Tris 1 5mol L PH 8 8 ml APS与TEMED混合后便会成胶 因此 依顺序 加 完TEMED后应立即进行灌胶 满意的位置是成胶 后 分离胶的上缘位于上方标记处的下缘 如果 制胶盒不够严密 则要自己掌控 稍多加一些 至下缘上1 3 灌注到位后 蒸馏水胶上封闭 30min SDS 10 ul 准备梳子 并依照配方配浓缩胶 配制好以后 吸取灌胶 注意吸取时 加样枪不要吹 避免气 泡产生 由一边缓慢注入 整个操作过程都应注 意 避免产生气泡 灌注满溢后 插入梳子 插 入过程可以缓慢 但不能拔出重插 避免气泡产 生 静置1h APS 10 ul 配置好的胶可以直接使用 如不使用 可以4 保存 TEMED ul 3 加样设计 设计好加样表格 并形成习惯 习惯将Mark放在 加在第一孔 例 4加样 加样时 要对准对应的样品孔 如果加样量较多 应使用细长的枪头 伸入加样 以免样品外溢 7 1WB7 1WB 名名称称 5电泳 70V 电泳10min 100V 电泳1hr 具体 的电压值应该根据蛋白质的大小进行调节 6 转膜 10 Gel10 Gel 胶胶的的 浓浓度度 6 1 膜的处理选择合适孔径的膜 裁剪成所需尺寸 5 IN 1 5sec 在通风橱中操作 1 加盖 保留备用 不要丢弃 5 IN 2 1min 在通风橱中操作 5 In 3 备用 1 甲醇 6 2取胶 将转膜的材料准备好 放在转膜槽中 将电极板 负极 黑 朝下放置 依次铺上海绵 滤纸 打 开电泳槽 取出玻璃板 选择锋利的切胶片 蘸 水 分离两块板 并将带胶的一片保留 将胶转 移至滤纸上 加盖膜 膜与胶二者之间不能有气 泡 膜最好只放下去一次 不要反复拿起放下 然后 放置滤纸 海绵 盖上正极板 白板 三明治 制作完成 固定于转膜槽内 加上冰 盒 再加倒入转膜液 一定要先加冰盒再加转膜 液 转膜槽要置于冰中进行电泳 380V 2hr 6 3转膜结束后处理 取下膜 丢弃胶与滤纸 5 IN 4 摇床洗脱5min 移入通风厨 5 IN 1 2min 沥干 放在白色滤纸上 移回正常 室内条件 自然晾干 7封闭 封闭液的选择 10 脱脂牛奶 1 BSA 量约15 20ml 添加完毕后 上摇床 1hr 8孵育一抗 1 按所需要的浓度配置1 Ab 2 用薄膜手套制 作孵育袋 并将5 放入其中 加注1 Ab 封闭 整个操作过程注意减少气泡的产生 制作完毕后 置入4 过夜 1抗要洗干净 9孵育二抗 取出已经过夜孵育1 Ab的5 直接放置在摇床上 1hr 然后取出 置入T BST中 摇床5min 3 次 二二抗抗的的摇摇床床洗洗涤涤时时间间最最好好不不要要延延长长 配置2 Ab 完毕后 将5 置入2 Ab中 摇床1hr 2抗的时间一定 不要太长 2抗 的稀释比例都 较大1 2000 1 5000 10曝光 取出2 Ab孵育完毕的5 放入TBST中 摇床洗涤 5min 3次 曝光机预冷 18 配置显影 液 1 1混合 将5 正面朝下 与显影液紧密 贴合 避免气泡 放入曝光机进行显影 1 甲醇 Stacking Gel 浓缩胶 8 8 10 10 12 12 15 15 3ml3ml6ml6ml 4 64 64 43 33 32 22 2dH2O ml2 12 14 14 1 2 72 73 33 34 45 5丙烯酰胺 30 ml 0 50 51 1 2 52 52 52 52 52 52 52 5Tris 1 0mol L PH 6 8 ml 0 380 380 750 75 100100100100100100100100SDS 10 ul30306060 100100100100100100100100APS 10 ul 30306060 6 64 44 44 4TEMED ul3 36 6 7ul well7ul well 加加样样量量 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 1010 MarkMa