酪蛋白胶束粉的陶瓷膜分离生产工艺.doc

11第9期 陈建行等：酪蛋白胶束粉的陶瓷膜分离生产工艺酪蛋白胶束粉的陶瓷膜分离生产工艺陈建行1，刘 鹭1，孙颜君1,2，苏燕玲1，张书文1，孔凡丕1，蒋士龙3，吕加平1（1. 中国农业科学院 农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193；2. 西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌 712100；3. 黑龙江飞鹤乳业有限公司，齐齐哈尔，161800）摘 要：为尽快建立酪蛋白胶束粉(micellar casein concentrate, MCC)的中试生产线，实现MCC在国内的工业化生产，该研究通过测定牛乳蛋白粒径，选取孔径40和100 nm的中空纤维陶瓷膜进行膜分离效果的对比，并选用膜分离效果较佳的陶瓷膜进行最佳操作参数的确定及稀释过滤工艺的研究，最后将自制MCC和进口MCC进行品质特性对比并分析其工业化生产的可能性。结果表明：孔径40 nm中空纤维陶瓷膜与孔径100 nm中空纤维陶瓷膜相比，渗透液中不含酪蛋白，能够减少酪蛋白损失，更适合于酪蛋白和乳清蛋白的分离，孔径40nm中空纤维陶瓷膜的最佳操作参数为操作压力2105 Pa，料液温度50；采用四段式的连续稀释过滤工艺，可使料液中酪蛋白占真蛋白的比例从69.39%提升至93.34%，真蛋白占干物质的比例从38.45%提升至88.15%；稀释过滤完毕后膜的纯水通量衰减了39.98%，经生物酶清洗液清洗后膜的纯水通量恢复至初始的98.02%；自制MCC在成分组成上与加拿大Proteinco公司生产的MCC相比差异不显著（p 0.05），但在溶解度和粉粒的微观形态上优于Proteinco MCC；生产1 kg MCC需要原料乳46.24 L，成本为244.58元，可实现其国内工业化生产。研究结果为实现MCC在国内工业化生产及其应用性研究提供参考。 关键词：酪蛋白胶束粉，陶瓷膜，膜分离，稀释过滤doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.09.000中图分类号：TS252.41 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-09-0000-11陈建行，刘 鹭，孙颜君，等. 酪蛋白胶束粉的陶瓷膜分离生产工艺 J. 农业工程学报，2013，29(9)：.Chen Jianhang, Liu Lu, Sun Yanjun, et al. Pilot scale production process of micellar casein concentrate powderJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(9): . (in Chinese with English abstract)0 引 言收稿日期：2012-10-29 修订日期：2013-03-04项目资助：国家十二五科技支撑课题资助（2011BAD09B01），北京市重大科技计划项目资助（D101105046010002）作者简介：陈建行（1986），男，河北衡水人，研究方向为乳品加工。北京 中国农业科学院农产品加工研究所，100193。Email: 通信作者：吕加平，（1963），男，研究员，博士生导师，研究方向为食品微生物与乳品科学。北京 中国农业科学院农产品加工研究所，100193。Email: 膜技术因具有操作温度低、节能、无污染等优点，已在乳品工业中取得广泛应用1-2，其中应用膜技术分离酪蛋白和乳清蛋白已成为目前国内外研究的热点3-4。应用膜技术分离脱脂乳中酪蛋白和乳清蛋白是基于各组分直径或分子量的不同，大部分乳清蛋白、乳糖、矿物质和水能透过膜成为渗透液，小部分乳清蛋白、乳糖和矿物质将和酪蛋白一起存留在截留液中。为了最大程度地脱除截留液中残留的乳清蛋白、乳糖和矿物质等，提高酪蛋白的纯度，在制备酪蛋白胶束浓缩液时需要多次加水进行稀释过滤，最终得到的酪蛋白浓缩液经喷雾干燥制备为酪蛋白胶束粉（MCC, micellar casein concentrate）5-6。MCC作为一种功能性乳基料，其酪蛋白占真蛋白的质量分数在90%以上，真蛋白质量分数在85%以上，并具有低乳糖、低脂肪及高钙等特点7，与传统的酸沉和酶凝酪蛋白产品相比，因没有乳的酸凝和酶凝过程而使得乳蛋白的天然胶束结构未被破坏，因此，具有更好的溶解性、起泡性和风味8。目前，MCC已广泛应用于食品工业中，国内需求的MCC主要依赖进口，且需求量在逐年增加。Zulewska等9分别使用孔径0.1 m均一压差陶瓷膜、孔径0.1 m梯度渗透陶瓷膜和孔径0.3 m卷式有机膜将脱脂乳浓缩3倍，研究结果发现三者对乳清蛋白的脱除率分别为64%、61%和38%。Beckman等10使用孔径0.3 m卷式有机膜对脱脂乳进行三段式稀释过滤，研究结果发现对乳清蛋白脱除率为70.3%，而Hurt等11使用孔径0.1 m的均一压差陶瓷膜对脱脂乳进行同样处理后发现乳清蛋白脱除率高达95%以上。由此可见：孔径0.1m的均一压差陶瓷膜更适合于分离酪蛋白和乳清蛋白，渗透液中酪蛋白的质量分数为0.20%，渗透液呈现白色浑浊，严重降低了MCC得率11。董晶莹等12使用孔径0.14 m多通道不对称陶瓷膜将脱脂乳直接浓缩9倍，实现了酪蛋白和乳清蛋白的膜分离，但该过程中膜的通量由93 L/(m2h)降低至13 L/(m2h)，膜污染严重。刘艳平等13采用切割分子量为300kDa的管式陶瓷膜对脱脂乳进行浓缩，发现渗透液中乳清蛋白占真蛋白的百分比达98.91%，但该设备的膜通量仅为0.12 L/(m2h) ，其工艺参数无法应用于工业化生产。迄今为止，国外使用孔径0.1 m的均一压差陶瓷膜虽有效去除了乳清蛋白，但膜分离过程中仍有部分酪蛋白渗透，严重影响了MCC得率11；国内在此方面的研究仍无法应用于实际生产12-13。本研究根据牛乳蛋白粒径的测定结果，选用2种不同孔径的陶瓷膜进行脱脂乳酪蛋白与乳清蛋白膜分离效果的对比研究，然后，对分离效果较好的膜进行操作参数优化及稀释过滤工艺的研究，最后，将喷雾干燥所得MCC与商品化Proteinco MCC进行对比并分析其工业化生产的可能性，选出适合酪蛋白和乳清蛋白分离的陶瓷膜，减少酪蛋白的渗透，并建立一套由巴氏杀菌、离心脱脂、稀释过滤、蒸发浓缩和喷雾干燥构成的MCC中试生产工艺，为MCC在国内的工业化生产提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂原料乳80 kg（蛋白质、乳糖、脂肪和灰分的质量分数分别为2.98%、4.58%、3.98%、0.67%，中国农业大学动物科学学院奶牛场），硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯），孔径100和40 nm的中空纤维陶瓷膜各一套（新加坡凯能高科技工程有限公司），膜清洗专用酶制剂（酶活力6104U/g，诺维信中国生物技术有限公司），Proteinco MCC 1 kg（加拿大 Proteinco公司）。1.2 仪器与设备沃迪杀菌机（上海沃迪科技有限公司），FT-15碟片式离心机（英国armfield公司），HFC-400陶瓷膜中试设备（新加坡凯能高科技工程有限公司，见图1），Foss-2300全自动微量凯式定氮仪（丹麦Foss集团有限公司），EPS301电泳仪（美国GE healthcare公司），AlphaEaseFC凝胶成像系统（美国Alpha公司），MicrotracS3500激光粒度分析仪（美国麦奇克有限公司），GEA Niro 喷雾干燥机（德国GEA工程技术中国有限公司），薄膜蒸发装置（上海德大天壹化工设备有限公司），Quanta200FEG场发射环境扫描电镜（美国FEI公司）。图1 HFC-400陶瓷膜中试设备Fig.1 Schematic of HFC-400 pilot plant equipment for ceramic membrane1.3 方法1.3.1 试验设计流程测定脱脂乳蛋白粒径根据粒径范围选取孔径100、40 nm的陶瓷膜，并对比膜分离的效果对分离效果较好的孔径40 nm的陶瓷膜进行操作参数优化选用孔径40 nm的陶瓷膜进行四段式连续稀释过滤工艺，动态监测该过程的相关指标参数的变化膜的污染与清洗蒸发浓缩并喷雾干燥得MCC粉自制MCC与Proteinco MCC进行对比工业化生产的可行性分析。1.3.2 脱脂乳蛋白质粒径测定取2 L原料乳，经FT-15碟片式离心机连续脱脂2次，使脂肪的质量分数控制在0.07%范围内。使用MicrotracS3500激光粒度分析仪湿法进样测定脱脂乳蛋白质粒径。1.3.3 100 nm陶瓷膜和40 nm陶瓷膜分离效果比较膜分离工艺流程：原料乳80 kg巴氏杀菌（72，15s）14离心脱脂（转速15000 r/min, 流速100kg/h）脱脂乳72 kg分两等份，料液分别过40 nm陶瓷膜和100 nm陶瓷膜过滤浓缩3倍（操作压力1.5105 Pa，两膜污染不严重；温度选为45，料液黏度低，且可防止乳清蛋白变性）截留液约12 kg，渗透液约24 kg。浓缩倍数的计算公式12：CF =Vi/(ViVp)，Vi为脱脂乳的体积，L；Vp为浓缩到某一时刻的渗透液体积，L。膜分离效果的定性分析：采用SDS-PAGE电泳判定膜分离截留液和滤过液中蛋白种类和大致含量。其分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为5%，其中脱脂乳稀释12倍，截留液均稀释30倍，渗透液均稀释2倍，与5倍样品缓冲液（体积比11）混合，沸水浴5 min，取10 L上样，电泳结束后进行染色、脱色至条带清晰并摄像。膜分离效果的定量分析：采用凯式定氮的方法，分别测定脱脂乳、截留液和渗透液中的总氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮，其中总氮按照GB-5009.5-2010方法测定，非蛋白氮参照GB/T-2008方法测定，截留液中非酪蛋白氮的测定采用文献15 方法，渗透液中非酪蛋白氮的测定采用文献16方法。1.3.4 40nm陶瓷膜操作参数优化操作温度对膜通量的影响：将操作压力固定为2105 Pa，分别在料液温度为30、40、50时对质量均为36 kg的脱脂乳样进行过滤浓缩，每隔10min测定各不同温度下膜通量随时间的变化。操作压力对膜通量的影响：将料液温度固定为50，分别在操作压力为105、1.5105、2105和2.5105 Pa条件下对36 kg脱脂乳浓缩3倍，观察在不同操作压力下膜通量随时间的变化。膜通量：单位时间、单位膜面积透过液的体积。用秒表记录1 min内透过液的体积，然后按照下列公式13计算：J=60V/At式中，J为膜通量，L/(m2h)；60为每小时的分钟数，min/h；V为1min内渗透液的体积，L；A为膜面积，m2；t为时间，min。1.3.5 脱脂乳稀释过滤工艺研究工艺流程：原料乳40 kg巴氏杀菌（72，15s）离心脱脂脱脂乳36 kg孔径40 nm陶瓷膜浓缩3倍(操作压力2105 Pa，料液温度50)，补水24 kg浓缩3倍，补水24 kg浓缩3倍，补水24 kg浓缩6倍，最终得截留液5.45 kg。稀释过滤过程中组分的动态监测：分别对截留液和渗透液中的蛋白质、乳糖、矿物质和固形物质量分数进行动态测定，其中蛋白质的质量分数采用GB5009.5-2010方法测定，乳糖的质量分数采用SNT0871-2000方法测定，灰分的质量分数按照GB5009.4-2010方法测定，固形物质量分数采用GB5009.3-2010中的直接干燥法测定。膜对物质A截留率和透过率的计算17：截留率=1Cp/CR100%；透过率=Cp/CR100%；其中Cp为渗透液中物质A的质量分数(%)，CR为截留液中物质A的质量分数(%)，物质A可为脱脂乳中的蛋白质、乳糖或灰分。1.3.6 膜的污染与清洗膜的污染程度常使用纯水通量衰减系数（WFD，water flux decline）来衡量，WFD越大表示膜污染越严重，计算公式18为：WFD=(J0Jt)/J0100%式中，J0和Jt分别为过滤前膜的纯水通量和过滤结束后仅用水清洗一次后的纯水通量，L/(m2h)。膜的清洗采用诺维信膜清洗专用酶。酶法清洗的程序依次为：50 L纯水冲洗，20 L清洗液（含酶量2）清洗20 min，30 L纯水清洗至洁净。膜的清洗效果可采用纯水通量恢复系数（WFR，water flux recovery）来表示，计算公式18为：WFR=JQ/J0100%式中，J0和JQ分别表示膜过滤前的纯水通量和清洗后的纯水通量，L/(m2h)。1.3.7 截留液的蒸发浓缩与喷雾干燥工艺1）将5.45 kg固形物质量分数为15.67%的截留液在60，9104 Pa真空度下19，使用薄膜蒸发装置进行蒸发浓缩，浓缩至固形物质量分数为26.13%，得浓缩液3.05 kg。2）将3.05 kg截留液在料液温度50，进口温度130，出口温度6319，入料流速2 kg/h的条件下进行喷雾干燥，最终得MCC 0.865 kg。1.3.8 MCC粉与商业产品的比较将自制MCC与商业化的产品从各组分的质量分数、粒径、溶解性与粉粒的微观表面结构进行对比，其中溶解性采用GB5413.29中溶解度的测定方法，粉粒的微观表面结构采用扫描电镜进行观察。2 结果与分析2.1 膜孔径、材质和组件形式的确定如图2所示，脱脂乳中大分子物质的粒径主要分布在2个范围内。粒径检测数据结果显示：20700 nm范围内的粒子占到了总粒子数的76.93%。相关研究报道20称原料乳中脂肪球的粒径范围为1 00020 000 nm，酪蛋白胶粒的粒径范围为20300 nm，酪蛋白的中值粒径为120 nm，乳清蛋白的粒径范围为36 nm。由于脱脂乳中仍有质量分数低于0.07%的脂肪存在，所以图2中大于1 000nm的组分为残余的大部分脂肪球，20700nm范围内的组分为全部酪蛋白胶粒和一小部分脂肪球，此外S3500激光粒度分析仪能检测到的最小粒径为10nm，因此图2中所显示的组分不含有乳清蛋白。粒径累积百分比Passing粒径间百分比channel粒径大小（微米）图2 脱脂乳中大分子组分的粒径分布Fig.2 Particle size distribution of macromolecular components in skim milk20700 nm范围内的组分主要为酪蛋白，S3500激光粒度分析仪检测到该范围内的D50值（粒径的中位数）为102 nm，这一测定结果与文献报道结果120 nm较接近20，而乳清蛋白的粒径分布为36nm，因此欲分离酪蛋白和乳清蛋白可以选用孔径为6100nm的陶瓷膜；但是在膜分离过程中，由于浓差极化作用，膜的表面会形成“二次膜”，二次膜的形成会严重降低膜的有效孔径，降低了乳清蛋白的透过率。因此，实际生产中采用膜的孔径通常是理论值的25倍，即理论上欲彻底分离酪蛋白和乳清蛋白可选用孔径12500nm的膜。实际生产中国外目前通常采用100nm的陶瓷膜21，而国内刘艳平采用的是截留分子量为300kDa的管式陶瓷膜13，董晶莹采用的是1400nm的多通道不对称陶瓷膜12。鉴于以上分析所得膜孔径理论值和实际经验值，并结合现有膜材料的孔径规格，本试验决定选用孔径100和40nm的2个膜进行试验。膜的材质和组件形式选择是分离过程的另一影响因素，在预试验过程中曾采用osmonics卷式聚醚砜膜进行试验，发现膜的污染十分严重，而且有机膜不耐酸碱和高温，大颗粒物质和脂肪也容易造成有机膜的划伤和堵塞，使用寿命短；不锈钢膜能耐受较高的压力和温度，坚固耐用，不易损坏，使用寿命长，但昂贵的价格令许多厂家望而却步。陶瓷膜主要有中空纤维陶瓷膜和管式陶瓷膜两种，对酸碱耐受较强，但对温度变化较为敏感，温度变化过快易导致膜管的破裂，此外已有报道发现管式陶瓷膜膜通量低于0.2 L/(m2h) 13，不适宜于大规模生产应用。综合考虑膜孔径、膜材质和组件形式对实际生产的影响，此试验选用100和40nm的中空纤维陶瓷膜进行膜分离效果的对比试验。2.2 不同孔径陶瓷膜分离效果比较2.2.1 SDS-PAGE定性分析 如图3所示，采用SDS-PAGE电泳对孔径100和40nm陶瓷膜的膜分离效果进行定性分析，结果显示：二者的截留液中均含有s-酪蛋白（s-CN）、-酪蛋白（-CN）、-酪蛋白（-CN）、-乳球蛋白（-Lg）和-乳白蛋白（-La）；孔径100 nm陶瓷膜的渗透液中s-酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白条带颜色较深，酪蛋白的质量分数较高，孔径40nm陶瓷膜的渗透液中3种酪蛋白条带颜色很浅，酪蛋白的质量分数较低。与此同时，试验过程中发现100nm膜的渗透液呈白色浑浊，而40 nm陶瓷膜的渗透液清澈透明，Zulewska等9研究发现孔径0.1 m均一压差陶瓷膜的渗透液呈现白色浑浊，并认为是由部分酪蛋白发生渗透引起的。Hurt等11研究称孔径0.1 m均一压差陶瓷膜的渗透液中酪蛋白质量分数为0.20%，严重降低了MCC得率，因此40nm陶瓷膜与100 nm陶瓷膜和0.1 m均一压差陶瓷膜相比在提高酪蛋白得率上更具优势。注：M为marker样品；1为脱脂乳样品；2、3分别为使用100 nm陶瓷膜在操作压力1.5105 Pa，料液温度45条件下将脱脂乳直接浓缩3倍所得截留液和渗透液；4、5分别为使用40 nm陶瓷膜在操作压力1.5105 Pa，料液温度45条件下将脱脂乳直接浓缩3倍所得渗透液和截留液。Note: M is the low molecular weight SDS marker (serial number: 17-0446-01) bought from GE healthcare; NO.1 is skim milk sample; NO.2 and NO.5 are retentate samples obtained from a 3concentration by 100 nm and 40 nm hollow fiber ceramic membranes at operating pressure 1.5105 Pa and temperature 45,respectively; NO.3 and NO.4 are permeate samples obtained from a 3concentration by 100 nm and 40 nm hollow fiber ceramic membranes at operating pressure 1.5105 Pa and temperature 45, respectively.图3 乳蛋白膜分离效果的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE gel Image of milk protein separation using membranes2.2.2 凯式定氮定量分析如表1所示，脱脂乳中乳清蛋白占真蛋白的30.61%，而原料乳中乳清蛋白占真蛋白的20%，这可能是由于在脱脂的过程中酪蛋白较乳清蛋白损失更为严重造成的。孔径100 nm陶瓷膜和孔径40nm陶瓷膜的截留液中乳清蛋白占真蛋白的比例为27.61%和26.83%，与脱脂乳中的30.61%相比均有降低，说明在膜分离的过程中乳清蛋白发生了渗透。孔径100 nm陶瓷膜和孔径40 nm陶瓷膜的渗透液中酪蛋白的质量分数分别为0.13%和0.04%，而0.1 m均一压差陶瓷膜的渗透液中酪蛋白质量分数为0.20%11，因此，与孔径0.1 m均一压差陶瓷膜和孔径100 nm的陶瓷膜相比，孔径40 nm的陶瓷膜更能减少酪蛋白损失，更适合于酪蛋白和乳清蛋白的分离，这与2.2.1中的SDS-PAGE定性分析结果是一致的。脱脂乳经孔径为40 nm的陶瓷膜3倍浓缩后发现，截留液中酪蛋白占真蛋白的73.17%，说明截留液中酪蛋白的纯度仍旧偏低，这会直接影响截留液在干酪生产中的应用，因此若要得到酪蛋白纯度较高的MCC，还需要进一步加水进行稀释过滤。膜过滤浓缩过程中，随着浓缩倍数的增加，料液中固形物的质量分数不断增加，料液黏度不断增加，膜表面浓差极化现象越来越严重，乳清蛋白、乳糖和灰分的透过率不断显著降低。为尽可能除去更多的乳清蛋白、乳糖和灰分，提高料液中酪蛋白占真蛋白的比例，只有采用反复加水稀释恢复乳清蛋白、乳糖和灰分的透过率，才能使截留液中更多的乳清蛋白、乳糖和灰分被脱除22。稀释过滤通常有3种方式：恒定体积补水过滤，变体积补水过滤和分段式连续补水过滤。目前国外在乳蛋白的分级分离过程中普遍采用三段式连续补水稀释过滤方式，而其他2种过滤方式主要应用在人血清白蛋白的分离浓缩与提纯方面23-24。此次试验为了得到纯度更高的MCC并建立MCC纯度与补水量的关系，采用四段式连续补水稀释过滤。表1 100和40 nm陶瓷膜蛋白分离效果定量分析Table 1 Quantitative analysis of protein separation by 100 and 40 nm ceramic membranes样品(Sample)粗蛋白Total protein/%真蛋白True protein/%酪蛋白Casein/%酪蛋白/真蛋白Casein in true protein/%乳清蛋白Serum protein/%乳清蛋白/真蛋白Serum protein in true protein/%脱脂乳(Skim milk)2.670.002.520.001.750.0069.390.230.770.0130.610.23a100nm截留液(Retentate)6.280.076.130.074.440.0572.390.101.690.0327.610.10b100nm渗透液(Permeate)0.410.000.330.000.130.0140.0159.792.19c40nm截留液(Retentate)6.500.026.340.024.640.0200.0026.830.11b40nm渗透液(Permeate)0.390.010.260.010.040.0017.480.370.210.0182.520.37d 注：100 nm截留液和渗透液是由100 nm陶瓷膜在操作压力1.5105 Pa，料液温度45条件下将脱脂乳直接浓缩3倍所得，40 nm截留液和渗透液是由40 nm陶瓷膜在操作压力1.5105 Pa，料液温度45条件下将脱脂乳直接浓缩3倍所得；结果表示为MeanSD形式，采用SAS9.0统计软件用LSD法对最后一列数据进行显著性分析（p0.05）；粗蛋白=总氮6.38；真蛋白=（总氮-非蛋白氮）6.38；酪蛋白=（总氮-非酪蛋白氮）6.38；乳清蛋白=真蛋白-酪蛋白。Note：The retentates and permeates of 100nm and 40nm ceramic membranes were obtained from a 3concentration process by 100nm ceramic membrane and 40nm ceramic membrane at pressure 1.5105Pa and temperature 45,respectively; Data was expressed means and standard deviation,the last column data were analyzed by LSD method using SAS9.0 software; Total protein=total nitrogen6.38; true protein=(total nitrogen-nonprotein nitrogen)6.38; casein=(total nitrogen-noncasein protein nitrogen)6.38; serum protein=(True protein-casein protein).2.3 膜分离操作参数的确定经2.2中的定性分析和定量分析，发现40nm陶瓷膜更适合于酪蛋白和乳清蛋白的分离，但在实际生产中膜通量是另一重要考察指标，膜通量直接影响到膜分离的效率，而膜通量主要受温度和操作压力的影响。2.3.1 温度对膜通量的影响膜通量在一定温度范围内会随料液温度的增加而升高，但若温度超过50，会引起部分乳清蛋白变性，导致部分-乳球蛋白和-酪蛋白结合，影响酪蛋白和乳清蛋白的分离25，因此该试验在30、40和50条件下考察了膜通量随时间的变化。如图4所示，将操作压力固定在2105 Pa，在料液温度为30、40和50条件下，膜通量随时间的推延均呈衰减趋势，且衰减速率为先增加后降低，但该过程中不同温度下的膜通量随温度的上升呈增加趋势，其主要原因有以下两点26：1）随着时间的延长、料液固形物质量分数增加，膜表面的的浓差极化现象不断加剧，造成膜表面“二次膜”的形成，膜表面阻力不断增加，当“二次膜”完全覆盖膜表面时，膜表面阻力趋于稳定，因此，膜通量衰减速率呈先增加后降低；2）随着温度升高，脱脂乳料液黏度不断降低，料液分子的通透性加大，膜通量上升。刘艳平等研究结果表明，在操作压力适中的前提下，某一时刻管式陶瓷膜的膜通量随温度的增加而递增，并且呈现一种线性关系J=0.0029T+0.0316，J为膜通量，L/(m2h)，T为温度，。但其最大膜通量小于0.2 L/(m2h) 13，与本试验的膜通量相差几百倍，这可能与组件形式和品牌有关。此外，料液温度选择为50，还可对污染微生物的生长繁殖起到一定的抑制作用，因此，选择50为较适料液温度。注：图为压力固定在2105 Pa，40 nm陶瓷膜在温度为30、40和50下膜通量随时间的变化Note: The operating pressure was controlled to 2105 Pa, membrane flux changes of 40 nm ceramic membrane at temperature 30, 40 and 50 with time increasing is shown in Figure 4.图4 不同温度下膜通量变化Fig.4 Membrane flux changes at different temperatures2.3.2 操作压力对膜通量的影响由图5可见，在1052105 Pa范围内，随着操作压力的增大，膜通量不断上升，但随时间延长膜通量衰减的幅度也不断增加；当操作压力增至2.5105 Pa时，膜的初始通量随压力的加大仍然呈增加趋势，但随时间延长膜通量衰减幅度过大，膜的平均通量显著（p0.05）降低。这是由于在低压阶段膜通量随压力的增加而增加；当压力过大时，可迫使一些大分子进入膜孔而加重了膜的污染甚至造成膜孔堵塞，膜通量随之降低。本试验中当压力为2105 Pa时，膜的平均膜通量最大，大于60L/(m2h)，且高于国外报道的卷式有机膜平均膜通量14.4 L/(m2h)和管式陶瓷膜平均膜通量51.2 L/(m2h) 10-11，因此，2105 Pa为本试验的最佳操作压力。注：图为温度固定在50，40 nm陶瓷膜在操作压力分别为105、1.5105、2105和2.5105 Pa下，膜通量随时间的变化Note: The feed temperature was controlled to 50, membrane flux changes of 40nm ceramic membrane at operating pressure 105, 1.5105, 2105 and 2.5105 Pa with time increasing is shown in Figure 5.图5 不同操作压力下膜通量的变化Fig.5 Membrane flux changes at different transmembrane pressure2.4 脱脂乳的稀释过滤工艺2.4.1 稀释过滤过程中膜通量的变化膜通量大小在一定程度上可间接反映乳清蛋白脱除速率的大小，乳清蛋白脱除速率可表示为每小时每平方米膜面积上乳清蛋白的透过量，即膜通量乘以渗透液中乳清蛋白的质量分数11。脱脂乳浓缩过程中，截留液中酪蛋白的质量分数不断增加，浓差极化现象加剧，膜的表面逐渐形成“二次膜”且不断加厚，严重影响了脱脂乳中可透过成分的渗透，因此，随着浓缩的进行，膜通量和渗透液中乳清蛋白的质量分数均呈下降趋势，即乳清蛋白脱除速率也逐渐下降。为提高乳清蛋白的脱除速率，只有采用加水稀释过滤的方法，降低浓差极化作用，消除“二次膜”，提高乳清蛋白分子的通透性20。图6所示为四段式连续稀释过滤工艺中膜通量和浓缩倍数（VCR, volume concentration ratio）随时间的变化情况。由图6可以看出，每个阶段随着VCR的增加膜通量都逐渐降低，但当补水至原体积时，膜通量得到了很好的恢复， 且较上一阶段有所上升。这一现象从侧面说明了补水稀释后，浓差极化作用降低，“二次膜”基本消失，乳清蛋白分子的通透性提高，乳清蛋白脱除速率也相应得到了提高。图6 稀释过滤工艺中膜通量随时间的变化Fig.6 Membrane flux changes with time increasing during diafiltration process稀释过滤是使用膜技术实现物料分离提纯的唯一方法，关于如何缩短稀释过滤所需时间，降低需水量，选择合适的补水时机是关键，国内外学者对此展开了广泛研究。孔凡丕等17曾对乳清纳滤脱盐的稀释过滤工艺进行了优化，结果表明当VCR=1.5时，膜通量显著降低，但若此时补水至原体积不仅膜通量恢复至原水平且脱盐率显著提高至88.14%；Foley24通过数学推导和试验验证得出：当料液浓缩至Cg/eCmacroCg时，是补水稀释的合适时机，其中Cg是膜表面凝胶层固形物的质量分数(%)，e为自然对数2.73，Cmacro为料液中大分子物质的质量分数(%)。通过分析可以得出：当脱脂乳浓缩至Cg/eCmacroCg时是合适的补水时机，此时膜通量虽出现大幅度降低，但补水后膜通量可恢复至初始水平。在本试验过程中，当VCR=3时，凯氏定氮测得料液中酪蛋白的质量分数Cmacro为4.84%，直接干燥法测得膜表面凝胶层固形物的质量分数Cg为11.91%，完全符合不等式Cg/eCmacroCg，且加水稀释后膜通量可以完全恢复，因此VCR=3时是合适的稀释补水时机。2.4.2 稀释过滤过程中各组分通透性的动态变化稀释过滤过程中，随料液各组分质量分数的变化，料液分子的通透性也会发生变化。如图7所示，蛋白质截留率呈阶段性上升，在每次刚加水稀释后稍有降低。开始阶段料液中乳清蛋白和酪蛋白比例较高约为44100，乳清蛋白易渗透，酪蛋白截留率较低只有77%；随着时间的延长，料液的固形物质量分数增加，浓差极化作用导致膜表面“二次膜”的形成，严重阻碍了乳清蛋白的透过而使蛋白截留率上升；第1次加水稀释使“二次膜”消失，但此时料液中乳清蛋白和酪蛋白比例已下降为15100，乳清蛋白的透过性略有降低，酪蛋白截留率较第1阶段有所提高。此后，第2、3、4阶段蛋白截留率的动态变化以此类推，其中3、4两阶段的蛋白截留率均在90%以上，此结果表明：残留在截留液中的乳清蛋白已在1、2阶段被大部分脱除。图7 稀释过滤工艺中各组分通透性的变化Fig.7 Changes of components permeabilities during diafiltration process乳糖透过率和盐分透过率的变化趋势，与蛋白截留率的变化趋势恰恰相反，其中乳糖透过率明显要高于盐分透过率，说明乳糖的脱除要比盐分的脱除更容易。脱脂乳中约有2/3的磷和钙以不溶性胶体磷酸钙的形式存在，严重影响了盐分的透过率，这是造成盐分透过率低的主要原因。钙和磷的截留可以使终产品MCC含有丰富的钙磷，添加到食品中有助于人体对磷和钙的补充，但是钙的质量分数过高会严重影响干酪的质地。为了降低对钙的截留，Brandsma和董晶莹等12,27曾以葡萄糖酸-内酯为酸化剂，将脱脂乳预酸化至pH值为6.0，结果显示截留液中钙的质量分数降低了20.1%，但乳清蛋白的质量分数却增加了12.6%，膜通量也大幅度降低。本试验的目的是为了制备富含天然酪蛋白胶束的MCC粉，考虑到预酸化对酪蛋白结构的影响，故未对脱脂乳采取预酸化处理。2.4.3 稀释过滤工艺中蛋白纯度的变化蛋白纯度是衡量MCC产品的重要指标，MCC蛋白纯度可以通过料液中酪蛋白占真蛋白比例和真蛋白占干物质比例来反映，图8显示了二者的变化规律。从图8可以看出酪蛋白/真蛋白和真蛋白/干物质随着时间的延长而增长，且增长速度逐渐趋于缓慢；酪蛋白/真蛋白在每一阶段的结束时刻分别为86.56%、90.16%、91.17%和93.34%；真蛋白/干物质在每一阶段的结束时刻分别为57.05%、71.65%、82.48%和88.15%。稀释过滤过程中酪蛋白被截留，乳清蛋白、乳糖和矿物质不断发生渗透，因此，随着稀释过滤的进行酪蛋白/真蛋白和真蛋白/干物质呈增长趋势；此外稀释补水后料液内乳清蛋白、乳糖和矿物质的通透性虽得到恢复，但是此3种组分的质量分数大大降低，直接影响了3种组分单位时间内的脱除率，造成酪蛋白/真蛋白和真蛋白/干物质增长速率的降低。图8 稀释过滤工艺中蛋白纯度的变化Fig.8 Changes of protein purity during diafiltration process2.5 膜的污染与清洗在稀释过滤工艺的第4个阶段，为了提高料液的固形物质量分数，稀释补水完毕后将料液进行了6倍浓缩，膜通量由最初的123.43 L/(m2h) 降至了L/(m2h)，说明此过程中膜可能受到了严重的污染。稀释过滤完毕后对40 nm陶瓷膜依次进行了纯水冲洗、生物酶清洗液清洗和纯水清洗，并在操作压力为105 Pa条件下对不同阶段的纯水通量进行测定，结果见表2。根据表2中数据计算得到膜的纯水通量衰减系数和恢复系数分别为39.98%和98.02%，说明在膜分离过程中，随着截留液中固形物质量分数的增加，凝胶层逐渐形成，膜受到了一定程度的污染，但经过生物酶清洗液清洗后，膜通量得到了很好的恢复。预试验过程中曾使用质量分数2%的氢氧化钠和0.5%的硝酸溶液进行清洗，膜通量的恢复系数在98%以上，但该过程需耗水150 L，排放酸液和碱液各30 L。与酸碱清洗相比生物酶清洗耗水量仅为100 L，且无酸碱液的排放和污染，因此采用生物酶清洗具有节水和环保的优势。表2 不同阶段40 nm陶瓷膜的纯水通量Table 2 Water flux of 40 nm ceramic membrane at different time纯水通量Pure water flux/ L/(m2h)超滤前Before ultrafiltration149.221.40纯水冲一次洗后After pure water flushed89.560.95生物酶制剂清洗后After biological-enzyme agent cleaning146.270.842.6 MCC品质特性的评价2.6.1 自制MCC与商业MCC的品质比较将自制MCC与加拿大Proteinco公司生产的MCC进行对比，分别测定了2种产品主要组分的质量分数、粒径和25下的溶解度。结果如表3所示，在水分、脂肪、矿物质、钙的质量分数和酪蛋白纯度方面，自制MCC与Proteinco MCC相比不存在显著性差异。在表观色泽上自制MCC为乳白色，Proteinco MCC为淡黄色，淡黄色可能是因喷雾干燥后喷涂卵磷脂所致26，自制MCC保留了乳蛋白的天然色泽，便于其在食品中添加和应用。在表观粒径上，自制MCC与Proteinco MCC相比粒度较细，其主要原因为本试验采用“一级喷雾干燥”并未采用流化床附聚而增加粉体粒径，此外还可能与旋转雾化器的转速、入料流速和雾化压力有关26。在溶解性方面，自制MCC显著优于 Proteinco MCC，这可能与喷雾干燥的进口温度差异和Proteinco MCC的贮藏时间有关系；Yuan Fang等19研究结果表明，当进口温度达155或178时，MPC85中酪蛋白的溶解性显著降低；Anema等28研究结果表明，一定温度下随着贮藏时间的延长，MPC85中酪蛋白与乳糖发生糖基化反应，导致MPC85溶解性随时间呈指数下降；MPC85和MCC虽在成分组成上存在差异，但二者中酪蛋白的质量分数均在60%以上，因此，酪蛋白溶解性的变化势必会影响MCC的溶解性；本试验中自制MCC的喷雾干燥进口温度为130，温度较低酪蛋白易溶解复水，且Proteinco MCC在室温下已贮藏8个月而使其溶解性降低。总之，自制MCC在成分组成上与Proteinco MCC不存在显著差异，在色泽和溶解性方面优于Proteinco MCC。表3 自制MCC与Proteinco MCC品质特性对比Table 3 Comparision of MCC self-made and Proteinco.MCC on characteristics自制MCCSelf-made MCCProteinco MCC水分Moisture/%3.83%0.40a4.05%0.35a真蛋白True protein/%87.48%0.66b85.55%0.47c脂肪Fat/%2.40%0.14d2.65%0.21d矿物质Minerals/%4.68%0.04e4.73%0.23e钙Calcium/%1.53%0.17f1.49%0.08f酪蛋白/真蛋白Casein/ture protein/%93.34%0.66g93.58%0.66g粒径Particle size/m35.732.10h61.431.25i溶解度Solubility/g79.650.78j66.772.06k色泽Colour and lustre乳白色淡黄色注：结果表示为MeanSD形式，采用SAS9.0统计软件用LSD法对每一行数据进行显著性分析（p0.05）Note: Data was expressed means and standard deviation,every column data were analyzed by LSD method using SAS 9.0 software.2.6.2 MCC粉粒的表面结构将自制MCC和Proteinco MCC使用场发射扫描电镜在高真空条件下，放大1000倍进行观察，结果见图9。从图中可以看出自制MCC在粒径上要显然低于Proteinco MCC，这与粒径的测定结果是一致的；在形态学上，二者表面均光滑细腻，略有光泽，但自制MCC要相对圆润和饱满，且颗粒小于PoteincoMCC，而PoteincoMCC要相对干瘪和皱缩。Pazos等29研究结果发现：与MPC80相比，脱脂乳粉表面粗糙没有光泽。Pazos等认为这是由于脱脂乳粉中乳糖质量分数高，喷雾干燥过程中乳糖在乳粉表面结晶所致，由此可以间接推断得出自制MCC和Proteinco MCC中乳糖质量分数低。Yuan Fang等19曾使用扫描电镜观察了不同喷雾干燥温度下MPC粉的表面形态，结果发现：当进口温度为178时，MPC粉脱水严重，呈皱缩态，复水较难，溶解度低，而在进口温度为77时，粉粒呈圆球形，复水较易，溶解度高。此试验中自制MCC在形态上较Proteinco MCC圆润，而且溶解度也高于Proteinco MCC，因此自制MCC在粉粒微观形态和溶解度方面优于Proteinco MCC。a. 自制MCC(1000)a. MCC self-made (1000)b. Proteinco MCC(1000)图9 MCC粉粒的扫描电镜图像Fig.9 SEM images of MCC partilcles2.7 工业化生产的可行性分析本试验使用40 L原料乳制备得到MCC 0.865kg，即制备1 kg MCC需要原料乳46.24 L，生产得率为2.16%，而原料乳中酪蛋白的质量分数为2.40%，相比之下MCC得率可观。表4中列出了原料乳成本及每一生产环节的电费、水费、劳动费和设备折旧费用，其中原料乳按3.5元/L，水费按4.5元/t，电费按0.45元/(kWh)，劳动费按6元/h，设备损耗按1元/h来计算，最终得出制备0.865kg MCC的总成本为211.56元，即生产1 kg MCC的总成本为244.58元，目前Proteinco MCC的市场价格最低为281.51元/kg，因此生产的利润可观。此