自写技术 免疫组化操作步骤 2013年7月4日.xls

免免疫疫酶酶组组织织化化学学技技术术 1 标本准备擦片 围绕组织将标本片擦干 不能碰到组织 注意正反面 2 脱蜡 50min 脱蜡 二甲苯I II 无水乙醇2道 95 乙醇2道 75 乙醇2道 每次3 min 侵入水中1min 3次 擦片 PBS浸洗3min 3次 3 抗原修复 历时约 4hr 1 配柠檬酸缓冲液 2 片盒中加入缓冲液 量要保证煮沸 后仍然能浸没标本片上的组织 3 置于微波炉内 大功率加 热至沸腾 4 Sample放入盛有煮沸的缓冲液的片盒中 加纸 盖 微波炉火力调整至可以使缓冲液保持沸腾状态 持续 10min 取出后自自然然冷冷却却保持缓冲液浸没标本片上的组织 取出沥干 擦片 H2O2 甲醇 3 100 浸没标本片30min PBS冲洗3min 3次 Trtion PBS 3 100 敷盖组织 暗盒孵育30min PBS冲洗3min 3次 4 封闭 封闭 选用胎牛血清 PBS 1 1敷盖组织进行封闭30min 血 清要求为除1抗动物来源意外的动物血清 时间到后切勿冲洗 5 抗体孵育 历时约 20hr 孵育一抗 稀释一抗 1 Ab PBS 10ul 100ul 湿盒准备 暗盒中倒入少量PBS溶液 记得设立对照组 将稀释完备的1 Ab敷盖组织 量要足够 避免抗体干掉 直视标本片送入4 环境 确保1 Ab敷盖组织 4 环境孵育过过夜夜 时间表约18hr 从4 环境中取回室温环境 PBS浸洗4min 3次 孵育二抗 1稀释二抗 2 Ab 0 3 Triton PBS 1 2000稀释 吸取时不要将枪头深入Ab内 在页面进行吸取 避免Ab挂枪 头外壁 2擦片 32 Ab敷盖组织 湿盒内室温孵育1hr PBS冲洗4min 3次 6 染色 历时约 20 25min 定表22分 钟左右 在5min左 右时 上镜看 DAB配置 DAB大白 小黑 1000ul 50ul 选加 1ul H2O2 配好后避光放置 抽屉是个不错的选择 用1000ul枪上染色 剂 1 2滴每片 湿盒内孵育20分钟 期间进行观察 由上至 下逐张标本片滴加 滴加完毕后约3min 逐张标本片上镜视 染色情况 适适时时终终止止 终终止止剂剂为为ddH2O ddH2O稍事冲洗 直直接接吸吸取取苏苏木木素素复复染染 1min 1min H2O冲洗3min 3次 7 盐酸乙醇分化 历 时30min 盐酸乙醇分化 HCl 70 酒精 1 100 0 5ml 50ml 由 上至下逐张标本片操作 每滴加完一片毕后 tap water 冲 洗 上镜观察 全部表本片操作完毕后 浸没在H2O中30min 目的在于苏木素的反蓝 自然晾干 晾干过程代替脱水 8 树胶封闭 常规树胶封片 用大枪头蘸取适量树胶 约1 2滴的量即可 切勿搅拌树胶 以免气泡生成 IHC的结果分析描述 阳性标记免疫 学特征 弱 中 强 三级 免疫荧光法 FITC为例 则表现为浅 绿色荧光 明显绿色荧光和亮绿色耀眼 荧光 免疫酶标记 HRP DAB H2O2 则表现 为淡黄色细颗粒 棕黄色颗粒和褐黄色 粗颗粒 后者耀眼易见 图像摄影 原 则上多取强阳性区域 阳性标记细胞 学特征 分为 胞膜型 胞核型 胞质 浆 型 微绒毛型和 复合型 胞膜 胞质 兼有 胞核 胞质兼有 或微绒毛 胞质 兼有 等五种阳性细胞类型 阳性标记组织 学特征 免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布 排列形式可以有如下7种 局灶型 弥漫型 片块型 网状型 腺管 型 腔缘型和 菊团型 等 低温保存的切片要复温 室温20min 烤片 60 70 1h Sample放入盒子中进行如下浸泡与浸 洗的步骤 配置 50ml50ml 100 100 1mol L1mol L A 液 H2O10ml 柠檬酸2 1g B液 H2O50ml 柠檬酸三钠1 22g A B液各自充分溶解后 丢弃10ml B 液 将二者混合 即配置完毕 使用 时调定PH至6 0 抗体的稀释浓度并不是确定的 要依 照实验进行调整 效果不好时 抗体 浓度应与标本与染料接触的时间 燃 料的浓度等 同时作为影响因素 进 行调整后再尝试 微微量量加加样样枪枪的的吸吸取取 不不能能按按到到最最下下面面 像像快快门门一一样样 半半按按 就就可可以以了了 余下步骤均在盒内进行 PBS冲洗均用一